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科研
B站ID：做科研的大师兄
文献阅读
来源：BV1q14y1H7o4
- 读懂文献的含义：不是简单的明白文献表层的字面意思，而是对文献的科研逻辑框架进行重建，将文献的科研逻辑内化为个人的科研思维
- 当然，文献正文中不会告诉你这种框架，这需要我们自己通过文献内容进行梳理，这篇文章的内容将中带你关注文献科研逻辑框架的梳理，而不是文中结果的细节
本次选用的文献：Oncometabolite d-2HG alters T cell metabolism to impair CD8+ T cell function
关注文章的title
- title传达出了文章的核心要义，而且体现出了关键的科研逻辑
- 第一层次：代谢物D-2HG损害了T细胞功能，T细胞功能可以看作一个表型
- 第二层次：代谢物D-2HG通过抑制T细胞代谢来抑制表型（机制）
读文献要关注这篇文章的通讯作者
- 能发出主刊的作者都是领域内的大牛，他们的最新研究成果都代表着本领域的研究前沿和研究热点，我们研究生做科研的最好办法就是去跟进本领域的研究热点，这样文章的创新性比较有保证，也会比较好发出去
- 平时，研究生们自己做课题，如果找不到方向，一个非常值得参考的方向，就是跟着领域内的大牛去做，比如，这篇文章关注的是代谢物对T细胞的影响，那我们就可以跟进这个方向，找一找是否有其他的一些代谢物，也可以影响T细胞的代谢。这样就相当于去模仿大牛的研究，相当于跟进了一个热点，那最后做出来的结果就比较好发文章，而且比较好发到一些质量比较好的文章上。
- 熟悉通讯作者会便于我们去查询ta实验室历年来发表的重要文章，每个实验室发文章做科研，通常都会有自己的经典思路（或者说是套路），而这种科研思路是一定程度上可以在他们的文章中体现出来的。我们通过跟踪通讯作者，找到ta们实验室的几篇重要的文献进行分析，我们就可以知道，ta们实验室选择的领域内的经典科研思路是什么，也便于我们在自己的科研中进行借鉴。
这篇文章的workmodel
Introduction
- 目的：引入“为什么要做这个研究”
- 要想做一个合理、靠谱的选题（或者说科学猜想），基本要依赖于两个层次的内容，分别是结合文献背景和合理的逻辑推理
- 文献背景：目前已经有大量研究证实，肿瘤细胞分泌的D-2HG代谢物促进癌症的发展，目前主要的关注集中在D-2HG在肿瘤细胞内部的作用，比如促进肿瘤细胞的增殖和转移
- 这篇文章基于文献背景，进行了以下的逻辑推理：肿瘤细胞来源的D-2HG作为代谢物，可以释放到肿瘤微环境中，我们知道肿瘤微环境有许多的细胞组分，比如免疫细胞等，而关于D-2HG是否会作用于肿瘤微环境中的其他细胞的研究是很少的，这是研究领域的空白，又因为CD8+T细胞是（免疫微环境中）发挥抗肿瘤作用的主要的效应细胞。
- 既然D-2HG可以促进癌症的发展，而且能够进入微环境中，那么我们是否可以猜测D-2HG接触了免疫微环境中的其他细胞，如果其接触到了CD8+T细胞，那一定会发挥抑制T细胞的效应。
- 科学猜想：肿瘤细胞通过释放代谢物D-2HG进入肿瘤微环境，D-2HG作用于CD8+T细胞，进而导致CD8+T细胞功能收到抑制，进而导致肿瘤细胞的免疫逃逸
- 逻辑推理的第二部分：为什么选择CD8+T细胞：我们知道D-2HG既然会出现在肿瘤微环境中，那它就可能接触到肿瘤微环境内的各种细胞，比如巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞等等，为什么作者这里关注于CD8+T细胞，文章中只有一句话去阐明，那就是“CD8+T细胞是（免疫微环境中）发挥抗肿瘤作用的主要的效应细胞”，但是这篇文章只靠这一点就确定下来…Em…不太可能，再看看
- 补充一下：大师兄在读这篇文献的时候，又做了一些背景资料的查找，发现在这篇文章发表之前，已经有一篇Nature Medicine的文章报道，D-2HG在肿瘤微环境里面可以被CD8+T细胞所摄取，然而这一点没有在这篇文章中被提及，但非常重要，因为D-2HG如果在肿瘤微环境中作用于一个靶细胞，那它应当被这个靶细胞所摄取，所以这篇文章应该也可以作为他们选择CD8+T细胞作为本项研究的切入点的依据之一（虽然这一点在文中其实没有提及）。
- 此外，这篇文章关注于代谢物D-2HG通过影响T细胞代谢来影响CD8+T细胞的功能，而他们研究团队的研究领域之一就是线粒体代谢，代谢也恰好是这篇文章解释机制的关键。
- 综合考察以上几个方面，我们认为这篇文章提出这样的科学假设离不开之前的内容，这样的科学猜想是有更大的概率被验证出来的。
- 任何人提出的猜想都没有100%的概率被验证出来，我们能做的就是基于零散的文献背景，然后提出有最大概率被证实出来的科学猜想或者选题，就是成功的。
Results
Fig.1
- 证实科学猜想中最主要的部份，D-2HG可以抑制CD8+T细胞的功能，所以首先做了D-2HG能够被T细胞摄取的实验
- 这个实验一定能做得出来，因为Nature Medicine已经报道过了。文章中没有提到这篇文章是因为，如果提到了，那创新性可能会打折扣。
- 后续也有功能学实验证明，D-2HG被摄取后，确实会发生CD8+T细胞的激活和增殖等收到了抑制，而CD8+T细胞的激活和增殖是这种细胞抗肿瘤所必须的一种表现
- Fig.1得到的结论：肿瘤细胞释放了D-2HG进入微环境，被CD8+T细胞摄取，因此抑制了CD8+T细胞的抗肿瘤作用，总结下来是揭示了主变量和表型（CD8+T细胞增殖）之间的关系
Fig.2
- 接下来，既然有了表型，那我们就要开始探究表型背后的机制了，为什么D-2HG能够抑制CD8+细胞的功能？
补充：做机制的常见思路是什么
- 这个物质（代谢物/基因），在之前的报道中，有没有报道过机制的内容，如果有，是什么？
这篇文章中是怎么做的
- 在这篇文章中，作者再次阅读了文献，发现相关的机制集中在表观遗传领域，在本研究中，作者检验了CD8+T细胞中的表观遗传学水平并没有发现明显的改变，因此作者排除了这种机制
- 那么，既然排除了别人报道过的机制，我们必然要尝试去发现一种新的机制，去解释D-2HG是如何抑制CD8+T细胞的功能，这时，作者就联想到了之前实验的结果，具体是具有快速性和可逆性，凡是做生物学研究的同学，通常会能联想到酶促反应，认为D-2HG抑制CD8+T细胞的功能，很可能是通过酶促反应，我们知道酶促反应通常和代谢过程有关，这就是为什么作者在逐渐把机制研究朝代谢的方向引入。
- 在明确了D-2HG可能在代谢方向发挥作用后，作者就进行了代谢组学的研究，通过代谢组学的实验结果，作者发现D-2HG可以显著抑制CD8+T细胞的糖酵解过程，丙酮酸向乳酸的转化过程被阻滞了，糖酵解过程也被抑制了
Fig.3
- 好的，现在我们对机制的研究细化到了糖酵解的水平，我们知道糖酵解是一个过程，这个过程是由若干个酶催化的，那么具体来说，是影响了糖酵解过程中的哪个酶呢？
- 在代谢组学的分析中，作者发现D-2HG不仅抑制了糖酵解反应，还抑制了乳酸的生成（丙酮酸-乳酸，无氧呼吸），前者的过程有一堆可能的酶，但后者只有一个，那就是乳酸脱氢酶LDH，所以作者可以猜测，D-2HG可能通过抑制了LDH，进而影响了糖酵解过程受到抑制，这部份的实验着重于验证这一点
我们在这里需要强调，D-2HG抑制LDH是整篇文章最上游的机制，最上游的机制意味着我们需要确保主变量与下游变量之间存在的直接逻辑串联，不管是通过文献关联，还是通过实验，都要有直接的关联，如果是间接的话，还要往上走，直到找到了直接接触的为止。
怎样找到能够直接串联的机制：如果没有文献报道，那这个时候只能做实验来证实了。 - 为什么要做体外实验：体外实验是最直接的，体系中只有两种物质，混合之后发现D-2HG影响下，LDH的活性确实下降了
- 如果LDH被抑制，那根据我们对丙酮酸转变为乳酸这个反应的了解，我们会知道这个反应同样伴随着NADH到NAD+的转换，在NAD+生成受到影响的情况下，糖酵解的相关步骤也会受到抑制，这就解释了我们的故事。
Fig.4
- 大家可能会问，在这一步之前，我们已经充分地讲述了逻辑链，为什么还要补充更多的内容呢？
- 我们知道，细胞获取能量的方式有两个，无氧状态下的糖酵解-丙酮酸转化为乳酸和有氧状态下的氧化磷酸化，在细胞内的无氧酵解被抑制的状态下，细胞内的氧化磷酸化水平会不会有所改变呢？作者想要探究更多，这里体现了大主刊的逻辑完整性。
Fig.5
- 这个部份使用了抑制剂的实验，也就是用已经明确可以抑制LDH功能的药物去作用于研究体系，发现出现了与本文主变量D-2HG同样的变化
Fig.6
- 在体模型的验证，机制和表型在小鼠体内做因果关系，和病人样本上做相关性
总结：主刊research article的完整课题框架设计
我相信，以我个人读文献的经验，大家如果能照着这种方式， 这种流程去分析一篇文献；在你已经精读了你的领域内，30篇左右的这种解析之后， 基本科研逻辑就没有任何问题了，不用再去求着别人帮你去设计课题。
不管以后设计课题也好，写文章也好，写基金也好，如果能完全把今天讲的这些东西给消化掉、理解薅， 那这些方面都是完全没有问题的。
表型创新：未报道的那种
充分阐明机制
- 细胞模型
- 至少三层的逻辑深度（不仅仅是做课题，写国自然基金，特别是面上基金的时候，是必不可少的）
- 主变量和最上层机制，非常推荐做直接关连的机制，决定IF=10和国自然青年/面上基金能不能中的重要标准
体内实验
- 动物模型
- 靶向关键的机制环节
- 进行因果的关系再现
病人的样本验证
- 机制环节
- 在病人样本中具有相关性