单细胞实验简介
单细胞数据可以回答什么生物学问题
- 研究样本里面，每一个基因类型特异性表达的基因是什么
- 所研究的样本里面有哪些细胞亚型，是否研究样本中存在新的或稀有的细胞亚群
- 在不同的细胞亚群中，有哪些信号通路被激活了？
- 不同样本之间的差异（药物处理前后的）
- 通过trajectory分析，了解到发育或疾病发展过程中，细胞状态的变化
单细胞数据分析的流程
- 分析流程：
实际操作中，我们会在各个步骤中往复进行，也就是需要“来回横跳”，来获得更好的分析结果
- 下机数据中得到的：原始的测序数据，通常是fastq文件
- 对原始测序数据进行处理，并计算出每一个基因的表达量
- 数据质控和细胞筛选
- 数据整合
- 聚类与可视化
- 差异表达基因分析
- 细胞注释分析
- 更高阶的分析……
单细胞分析的主要软件工具
cell ranger
- 10x研发的软件集，用于处理10x的单细胞数据
Loupe R & Loupe Browser
- Loupe R是一个R的软件包，可以把Seurat数据转换成Loupe Browser文件
- Loupe Browser是一个桌面软件，可以提供简单易用的界面，对10x的单细胞数据进行分析和可视化
有用的第三方软件工具
- 以下简称“三方工具”，是一个意思
- 独立运行的软件包
- 虽然10x对这些第三方工具不提供技术支持，但是这些第三方软件大大拓宽了我们进行细胞分析的广度和深度
细致的单细胞分析流程
数据预处理
- 首先，对原始测序数据的read进行预处理，用到的工具是cell ranger
- cell ranger可以获取细胞的barcode信息，并将read比对到参考基因组上，以此计算出每个barcode内，每个基因捕获的RNA数目，也就是UMI
- 在这一步之后，我们可以得到一个feature barcode的矩阵，这个矩阵包含着每个barcode，每个基因对应的UMI数（也就是转录本的数目）
- 但是，有一些barcode不一定包含细胞，而只是背景噪音而已
质量控制与数据筛选
- 对原始的feature barcode数据质控，过滤掉没有细胞的barcode
- cell ranger可以进行基本的质控分析，提供一些重要的指标，帮助分析样本和数据的质量，去掉没有细胞的barcode，剩下有细胞的barcode，并给出测序和比对等重要的质量指标
- Loupe browser可以去掉低质量细胞的barcode，过滤的标准包括每个barcode里面的基因总数，以及线粒体基因表达的百分比
在质控和过滤到低质量的barcode之后，我们将得到高质量的细胞群，进行下一步的数据分析
（可选）数据整合与去批次效应
- 数据整合
- 当我们有很多样本的时候，通常我们可以考虑将这些样本整合起来，进行分析，这一步可以使用Cell Ranger，也可以使用三方软件
- 目的：整合不同的样本得到的单细胞数据
- 如果有批次效应（多种技术要素造成），还要去批次
- 如果不同的样本间在tSNE或UMAP图上能显著的区分开（上图1），那就提示具有明显的批次效应，我们就需要对这两个样本进行去批次效应来整个分析
- 批次效应是由多种技术因素造成的，如果对相同的生物样本使用相同的10x试剂，并同时处理，这样的批次效应可能就很小
- 然而，如果样本是在不同的时间，由不同的人员进行处理，批次效应可能就比较显著
聚类和可视化分析（tSNE和UMAP哪个更好没有定论）
- 根据细胞的基因表达谱对细胞进行分组，并在二维的图上进行数据的可视化（单细胞数据很复杂，我们需要降低维度，以便我们能在二维平面上看到单细胞数据）
- 常见的可视化方式是tSNE和UMAP，对于相同的样本，这两种方法可以提供略有不同的，集群群体的结构
- 单细胞数据分析是一个非常活跃的领域，tSNE和UMAP到底哪一个可视化效果更好，还没有明确的结论，可以根据自己的数据和参考文献来选择分析方法
差异基因表达差异分析
- 对每个聚类进行差异基因表达分析，这个步骤可以在cell ranger的默认参数下进行，并且自动得到相应的结果
- 也可以使用Loupe Browser和三方软件来实现同样的目的，使用这些软件进行差异基因表达的分析可以是高度定制化的
- 在这个步骤中，我们经常要做的就是把每个cluster的细胞和其他cluster的细胞进行比较，然后找到他们之间的基因表达的差异，输出的结果是每个cluster中富集的基因列表，以及这些基因对应的倍数变化，还有调整后的p值
- 在使用Loupe和三方软件的过程中，我们可以定制在两个特定的细胞群之间进行差异分析
细胞注释
- 找到每个cluster，并且对每个cluster进行细胞注释
- 进行这个步骤由很多选择，我们可以根据上一步发现的，每个cluster的marker基因进行手动注释，也可以用一些三方软件进行自动的细胞注释
- 在这一步结束之后，所有的cluster都会被注释为特定的细胞类型
一些三方软件介绍
- 非常流行、有用的分析工具：Seurat和Scanpy，都可以对单细胞数据进行分析和可视化
- 更高阶的数据分析可以通过三方软件进行
- 信号通路分析，找到不同cluster中富集了哪些基因
- trajectory/RNA速率分析，判断细胞状态之间的转变
- 可以通过scRNA-tools数据库来探索用于单细胞数据分析的工具目录
- 10x的官网上也有不同主题的分析指南，包括single-cell, Visium（含HD）和Xenium，可以看analysis guide，这里有致力于解决高阶数据分析问题的内容，这些内容也将不断被丰富
Loupe R
* 虽然Loupe Browser提供了非常直观的分析界面和强大的分析功能，但一些高级分析，比如细胞的自动注释，或者批次矫正仍然无法在Loupe Browser中完成，而Seurat等三方工具可以完成这些分析
* 现在，用户可以使用Loupe R这个软件包，将两个平台进行结合，Loupe R允许用户将Seurat数据转化为Loupe Browser文件
* 比如，在使用Seurat进行批次矫正之后，我们可以使用Loupe Browser进行更多的下游的数据分析
各种软件的运行要求
Cell Ranger需要的技能
- Linux系统执行各种程序
- 了解实验设计
- Linux系统中的命令行
- 所在机构的数据管理系统
- Linux系统出现问题的时候，我们要联系谁
Loupe R & Loupe Browser
- Loupe R：基本的R编程的语言
- Loupe Browser：苹果或微软操作系统
- 实验设计与生物学知识
- 诠释差异表达基因的结果
三方软件：例如Seurat和Scanpy
- 实验设计与生物学知识
- R与python的编程能力
- 软件包的默认参数
- 诠释数据分析的结果
- 10x support官网有更多说明