关于芯片的若干问题
选择3’-IVT芯片还是WT芯片？
- WT芯片一般比3’-IVT芯片更好，从上图中可以看到3’-IVT芯片有各种各样的限制，而这些恰恰是WT芯片的优势
做3’-IVT选什么芯片?
- 可能的选择：Affymetrix U133/Affymetrix PrimeView/ Agilent SurePrint G3
U133系列经典但造价高，报价5000元
- 价格没有优势
- 而且3’-端探针较短，只有25mer，假阳性率较高，对于3’-端近似的基因区分能力差，转录本辨认能力差，建议排除
PrimeView系列价格便宜，报价3000元，缺点同U133系列
Agilent 的SurePrint G3系列报价3600元
- 探针60mer，设计决定一个序列对应一个探针，对基因注释比较准确
- 注释基因多，覆盖LNCipedia 2.1、RefSeq、Ensembl、UniGene、GenBank等多个基因库
- 能同时进行8个样本的检测
- 性价比高
转录本水平的检测？可变剪接？
- WT芯片的好处在于可以检测全转录本表达谱，是转录本水平的检测，且可以进行可变剪接的选择和分析，也比U133系列准确，可以检测lncRNA
如果要研究lncRNA和基因表达
- 可以优先选择Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression v3 8✖️60K Microarray
如果要研究转录本水平的表达
- 至少需要HuGene 2.0 ST（3800元）
- 更贵的选择包括 HuEx 1.0 ST（4000元左右）和HTA2.0（4300元）
如果要研究可变剪接
- 至少要选择 HuEx 1.0 ST（4000元左右）
- 最推荐的选择是HTA2.0（4300元）
- Illumina的Human HT-12 v4也是可以选择的，其报价未知，但推测比HuGene 2.0 ST（3800元）便宜，且效力在前者和HuEx 1.0 ST（4000元左右）之间。
- Human HT-12 v4能做到这一点是因为1.它的探针是精选特异性和敏感性最优的探针，减少了 Affymetrix芯片可能的探针冗余2. 探针较长，有50-mer，进一步提高了准确性
研究lncRNA用什么芯片
- Affymetrix HuEx 1.0 ST（4000元左右）
- Affymetrix HTA2.0（4300元）
- Agilent SurePrint G3（3600元）
- Agilent 定制化芯片（针对lncRNA，甚至是ceRNA）
其他要求
定制化芯片/双色芯片…
样品珍贵/追求性价比
- Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression v3 8✖️60K Microarray
- Illumina Human HT-12 v4
一次性研究多个组学
- Affymetrix HTA2.0（4300元）
- Agilent定制芯片
其他芯片
研究基因变异/做全基因组关联研究（Genomewide association studies，GWAS）
- 选择Illumina芯片
- Affymetrix的CHB1和CHB2也是可以选择的
单核苷酸多态性SNP
- Affymtrix的SNP 6.0比较经典，但后劲乏力
- Illumina的SNP可能是更好的选择
DNA甲基化
- Illumina Infinium Human Methylation 850K BeadChip
比较基因组杂交CGH
- 一项在不培养细胞的情况下，分析相对于参照样品，测试样品的DNA中拷贝数变异的技术
- Agilent CGH芯片或CGH+SNP芯片
三种芯片的组成/概念层级
- Affymetrix和Agilent都属于microarray，其探针是一个一个方阵去排列的
- Illumina属于BeadChip微珠芯片
- ProbeSet是探针集的意思，几种不同序列的探针同时指向一个探针ID，我们在表达矩阵上看到的每一行探针名就是一个probe set，Affymetrix专属
- 其芯片采用多位点探针设计，即一个基因或一个转录本设计多种探针，综合评价基因表达量
- 而且，对于一个基因或一个转录本，可能还不止一个probeset
- Agilent和Illumina芯片并不需要这个概念，其探针一般是最优的，一种探针对应一个转录本
- Feature是芯片探针合成点或探针合成单元，也就是芯片扫描图上的一个光点，由完全相同的探针组成，适用于Affymetrix和Agilent，一般每种探针对应至少一个feature
- Beads是微珠，Illumina的beadchip，每个bead表面都各自耦联了70万个某一种相同序列的DNA探针，一个反应池内大概有30个相同序列的beads
- Probe指的一般是一根DNA探针链
- Affymetrix一个feature可以有百万个probe
- Agilent不需要这么多
- Illumina一个bead表面有70万个probe
- Probe也可以指某一种序列的探针或者探针集Probeset
GEO数据库各平台的使用排名
- 测序呈现上升趋势；芯片检测逐渐式微，但甲基化检测仍然是芯片最多，短时间内应该还不会被取代
测序v.s.表达谱芯片
RNA测序技术
- 不需要物种或转录本特异性探针
- 它可以检测新的转录本、基因融合、SNPs（包括突变） 、INDELs（小插入和缺失）以及芯片无法检测到的其他未知的变化，而芯片是个相对封闭的系统，即只能对已知的序列进行检测
- 有更宽的动态范围
- 用芯片杂交技术，基因表达测量受到低端背景和高端信号饱和度的限制，RNA-Seq技术产生离散的、数字排序的读长（reads）计数，并且可以在更大的动态范围内量化表达
- 在加大测序深度的前提下，RNA-Seq可以有更高的特异性和灵敏度；与微阵列相比，RNA-Seq 技术可以检测到更高比例的差异表达基因，特别是低表达基因。对稀有和低丰度转录本的检测也可以通过测序覆盖深度增加解决。而芯片的分辨率是固定不变的
- 如果选择测序，还一定要注意：一是建库类别，即全基因组还是全外显子组测序，二是测序深度，现在基本要100×以上的 coverage了
芯片杂交技术
- 芯片进行定量会更为准确
- 对比一般的测序深度，研究低丰度的转录本或者基因，或样本为石蜡包埋组织（RNA降解严重），可能选择芯片更有优势
- 芯片可以同时对多组学进行一次性检测，比如一张芯片可以同时对编码基因表达、lncRNA和miRNA进行检测（测序由于建库方法的不同，一般需要进行分别检测）
- 相比于测序，无论是实验过程还是数据分析过程，芯片都更为成熟和简单
- 对于新手来说，测序报告可能会比较复杂，而芯片比较简单掌握，直接上手使用
