- Agilent公司的产品主要为全基因组测序芯片，产品主要为全基因组表达谱芯片、CGH、CGH+SNP芯片等，其最突出的就是CGH芯片
- 除了CGH芯片和表达谱芯片之外，还提供microRNA芯片、甲基化芯片、ChIP 芯片和基因合成用的Oligo Library Synthesis芯片等
Agilent表达谱芯片的特点
- 独特的芯片制作技术，灵活性强
- Agilent基于打印原理的芯片合成技术，给予其在制作不同序列的探针的时极大的灵活性。只要更换芯片探针的设计文件，就可以轻松地制作出一张全新序列的芯片来。Agilent 公司在接受客户定制化芯片的时候，可以接受少到1张芯片的定制化订单。
- 在cRNA链上直接标记Cy3荧光基团，检测过程快，比生物素标记减少1天时间，需要的步骤也更少（Agilent 2天，别的平台3天+）
- 检测线性范围更大，可以达到10^5，可以检测更高、低表达的基因（别的芯片一般只有10^3）
- 60mer长探针、特异性好
- 样本用量少
- 可以选择双色（双通道）芯片检测
根据点阵密度进行分类
- 密度较低：HD芯片，一张芯片上最多可以有244000个点
- 密度较高：G3芯片，一张芯片最多可以有1000000个点，可以检测超过49000个人类基因和转录本
根据点阵分区进行分类
- 分区越多，一个芯片可以同时检测的样本的数量就会越多
- 但分区过多，每个样本可以检测的数据点是会减少的
- 目前运用较多的商业化芯片（人的）
- SurePrint G3 Human Gene Expression v3 8x60K Microarray Kit
- SurePrint G3 Human GeneExpression 8x60K v2 Microarray Kit
- 和 Whole Human GenomeMicroarray Kit 4✖️44K芯片
- 其中8x60K代表8 个区每个区60000个探针，提供了人转录组的全面覆盖，如长链非编码RNA (lncRNA)数据库 LNCipedia 2.1，基因数据库RefSeq、Ensembl、UniGene、GenBank等
Agilent表达谱芯片的组成
Agilent表达谱芯片制备的基本原理和步骤
- Agilent芯片的基片是一张玻璃硅片，大小和标准病理载玻片相同
- 芯片制作过程类似喷墨打印，墨水是含有保护基团的4种核苷酸，这些墨水小液滴会以设计的探针顺序，依次层叠地以3’-5’的顺序被喷到玻璃板对应的位置上
碱基延长过程的3步骤
- Agilent的这个DNA链合成技术，每一步的合成效率都非常高，可以达到99%以上。这让 Agilent可以在芯片上得到很长的DNA链，最长可以达到300个碱基的长度
偶联
- 第一个核苷酸（带有游离的5’-OH）首先被喷到玻璃板上，与硅基质结合
- 第二个核苷酸（5’-OH被保护基团修饰）接着被喷到玻璃板上，第二个核苷酸会与第一个核苷酸的游离的5’-OH起反应，使两个核苷酸之间通过共价键连接
氧化
- 第二个核苷酸通过亚磷酸基团与第一个核苷酸连接，氧化的目的是把这一亚磷酸基团氧化为磷酸基团
去保护基团
- 连接在第二个核苷酸碱基5’-OH上的保护性DMT基团去除，暴露出游离的5’-OH，供下一步反应进行
Agilent表达谱芯片检测的基本原理和步骤
- 检测原理基于3’-IVT
- 每个样本的处理方法（一个样本做一次，两个样本做两次然后混合）
- 首先使用先用Oligo dT引物（带T7启动子）和M-MLV逆转录酶得到第一链的cDNA，然后再转录或复制出第二链的cDNA，得到双链cDNA，这个双链cDNA是带有T7启动子的。
- 接下来，使用T7逆转录酶、Cy3荧光基团（如果有两个样本，另一个样本是Cy5荧光基团）标注的CTP进行转录，这样新产生的cRNA链就有荧光标记了
- 对cRNA进行纯化，用纯化后的样本与芯片探针进行杂交，在激光扫描仪下获得每个点的荧光强度，并计算出对应基因的 RNA表达量
- 单色荧光计算荧光强度，双色荧光计算两种荧光（也就是两个样本）的比值
- Agilent扫描仪和装入了扫描仪的芯片⬇️
双色芯片的数据处理
- 称标记了第二种颜色的样本为参照组reference，可以是对照组，也可以没有对照关系，仅仅是一个参考
- GEO上使用Agilent双色芯片的数据集，常常给出的是两种基因的表达比值，并且取log2，但也有些数据集虽然用的是双色芯片，但只用了单色但样本，这个时候就直接和普通单色芯片一样分析就好了
Agilent还做miRNA芯片
- 其特殊的探针设计还可以区分miRNA前体和成熟的miRNA
- 对样本方面，该芯片无需分离miRNA，直接用total RNA进行实验，只需要100ng RNA，就可以进行标记实验了，避免了分离富集放大的过程带来的影响
