复习讲过的论证套路
- 单变量论证套路
- 二元变量论证套路
- 三元变量论证套路
三元变量的论证套路
在三元结构中，一般承担主变量任务的是分子，分子的下游效应因素可以是分子或通路，上游驱动因素可以是药物或分子
- 常见的三元变量文章结构
- 药物+分子+分子/通路
- 分子+分子+分子/通路
- 把三元变量拆成两个二元去理解论证套路
- 主变量A与下游因变量B之间的调控三步
- 上游因变量C对A和B的调控关系
- C调节A和B
- C调节表型依赖A
- C调节表型依赖B的rescue可以省略，只保留主变量的部份
本期介绍的文献
复习：细胞自噬与细胞凋亡的cross-talk
- 这里可以复习文献精读 Lesson 2的内容
复习：文献阅读步骤
文章1
读题目&假设逻辑
- 虽然这里有三个分子，但是如果对基础科研有一些体会的同学可以了解miR-221和Beclin-1都是常见的明星分子，在这里用作因变量
- 所以我们可以确认文章的主变量是mda-7，或者说IL-24
- 如果没有对应的基础，或者说想用一些比较粗暴的方法去确定研究的主变量，就看标题中出现的第一个分子吧，这是一个比较讨巧的方法
- 假设逻辑在上图
- 只做了MDA-7的下游调控，没做上游驱动
Fig.7
- 先看Fig.7了解一下本文的论证结构
- 注意图中的两个箭头，miR-221的”↓”提示IL-24与miR-221之间是负调控的关系，Beclin-1旁边的”↑”提示在miR-221被调控减少的情况下，Beclin-1的表达反而升高，所以miR-221和Beclin-1之间也是负调控的关系，搞清楚调控关系有助于我们理解这篇文章rescue实验的设计思路
Fig.1
- 一上来就是二元变量的机制研究，这种两两调控的“降维处理”是符合我们对文章论证套路的期待的。
- Fig.1a，Ad.null是对照，Ad.mda-7是过表达的载体，纵坐标是RNA水平作者检测了同一个家族的两个分子miR-221和miR-222，当过表达mda-7的时候miR-221的水平下降，是分子调分子的论证
- Fig.1b还是过表达mda-7，在不同的病毒滴度下检测mda-7蛋白的表达，属于分子操作的验证（蛋白水平）
- Fig.1b还做了给不同病毒梯度下检测miR-221的浓度，又是一个分子调分子的证据
- Fig.1b最右边的图，是过表达mda-7检测增殖表型，用的是MTT比色法检测吸光度
- Fig.1c做了不同的病毒感染时间与miR-221水平的关系，结果与Fig.1b是一致的
- 总而言之，Fig.1做出来的结果是mda-7负调控miR-221
Fig.2
- 在多种肿瘤细胞系中，mda-7负调节miR-221
- 这个和我们的结果预期不太一样，因为医生做科研一般都是限定在某种具体的疾病当中，即便是做肿瘤课题也会选定某个肿瘤，比如肺癌LC，乳腺癌BC，结直肠癌CRC，甚至会专注在某种亚型上，比如三阴乳腺癌，激素非依赖的前列腺癌等；但是这篇文章中没有这样的局限，用了非常多种肿瘤的细胞系
- Fig.2a是在乳腺癌细胞中过表达mda-7，检测下游的miRNA，Fig.2b干了同样的事情，但是换了一批细胞系，得到的结果是一致的
- Fig.2c和d的结果不一样，横坐标出现了His mda-7，发现是外源添加的纯化重组蛋白，文章的分组，这里的分组是A549和Du-145，前面的A549是IL-24受体缺陷型的细胞株，Du-145是受体非缺陷的细胞
- mda-7又称为IL-24，是一种分泌型的细胞因子，大多数的细胞因子都是通过结合细胞表面的受体发挥对应的生物学效应的，所以Fig.2c在受体缺陷型的细胞系中加入mda-7，发现miR-221的水平没有显著变化，相对应地，对于没有受体缺陷的Du-145细胞，加入了纯化的mda-7蛋白后，miR-221的水平出现了降低，说明mda-7需要结合相应的受体发挥生物学效应
- 为了进一步明确受体在肿瘤中的贡献，作者构建了过表达载体的细胞系，然后发现小RNA的受体水平发生了变化，说明mda-7是需要受体发挥生物学功能的。
Fig.3 回复实验
- Fig.3a&b：回复实验，同时过表达mda-7和miR-221，观察凋亡和增殖表型
- Fig.3c：同样的回复实验，同样检测凋亡表型，只不过换了一种检测方法
- Fig.3d：分子操作，构建了一系列稳转株，去检测miR-221的表达，是分子操作的验证。
- Fig.3e：回复实验，检测增殖表型，换了克隆形成的检测
Fig.4
- 支线任务
- 这张图中用到了一系列的ROS激活剂和抑制剂，其中NAC是抗氧化剂，ATO、Pyo和H2O2是促氧化剂
- Fig.4a、b、c三张图的上半部份检测的是miR-221的水平，下半部份检测的是ROS的水平，在过表达mda-7并且加入促氧化剂ATO后，可以观察到miR-221的水平下降了；并且如果过表达mda-7，并且在体系中依次加入ROS的激活剂和抑制剂，miR-221的水平就不再升高了，提示mda-7通过ROS调节miR-221
Fig.5
- 另外一组二元变量+直接机制
- Fig.5a-b：过表达miR，观察Beclin-1的表达，其中Fig.5b给了不同浓度的miR载体，发现Beclin-1的表达受到抑制的程度是剂量依赖的，这种剂量依赖关系也能提示两者之间的关系* Fig.5c：回复实验，同时过表达了mda-7和miR-221，观察自噬相关marker Beclin-1，细胞周期相关marker p27和凋亡相关marker PUMA。
- Fig.5d：验证miR-221与Beclin-1直接结合的实验，过表达miR-221，Luciferase活性显著降低，把结合位点突变掉，Luciferase活性就没有显著差异了。
- Fig.5e：分组加入了抗miR-221的抗体，也就是减少miR-221，Beclin-1表达升高。
- Fig.5f：这里是分子的双操作，分别是同时操作mda-7和miR-221，以及同时操作miR-221和Beclin-1观察细胞凋亡表型
Fig.6
- 动物实验，其中设计了在体Rescue
- Fig.6a和b有两种不同的操作，左边是先成瘤，然后瘤内注射病毒进行基因操作，类似于模拟治疗的效果；右肿瘤是现在细胞内做完基因操作再成瘤
- 在所有的Vector组，只要过表达了mda-7，肿瘤的大小就都是显著降低的，左右肿瘤的结果一致。
- 在过表达miR-221组，过表达mda-7对瘤体的抑制作用不明显，如果同时过表达miR-221和Beclin-1，会使肿瘤对mda-7的抑制生长作用变得敏感，Fig.6d是相应的免疫组化结果，这种在体的三变量操作难度是非常大的
总结
- 两两组合
- mda-7+miR-221
- miR-221+Beclin-1
- 亮点
- miR-221结合靶基因的直接作用机制
- 两两回复的实验
- 数据维度方面，多个细胞系
- 虽然对主变量mda-7只有单边的过表达操作，但是这是出于临床实际情况这样设计的，可以理解
- 变量三操作的动物实验
文章2
读题目&假设逻辑
- TNF和STAT的关系已经有报道了，他们之间的关系论证不是最重要的环节
Fig.1
- 表达差异的结果
- 两种样本： 黏膜组织和外周血单个核细胞
- Fig.1a-f使用了ELISA检测ROCK2的表达水平，其中Fig.1a和b分别检测的是组织和外周血中的ROCK2，横坐标意义见图，说明ROCK2在疾病组中高表达
- Fig.1c和d实验方法和Fig.1a以及b是一致的，区别是做了免疫共沉淀IP
- Fig.1e和f是同一个病人中的炎症组织和非炎症组织，炎症组织中ROCK2的表达高于非炎症组织
- Fig.1g用免疫组化IHC的方法去检测ROCK2，换了个方法说明ROCK2是高表达的
- Fig.1h-j选了一堆临床评分，证明ROCK2高表达和疾病进展有正相关
Fig.2
- Fig.2a和b依然是在组织和外周血中检测ROCK2，检测了多种细胞，发现在CD4+的细胞中是高表达的，在这里建立了主变量和表型之间的相关性。
- Fig.2c加入了不同的细胞因子，观察到TNF对ROCK2的作用最为显著，Fig.2d和e是TNF对ROCK2的影响有作用依赖和时间依赖的结果，进一步说明了TNF对ROCK的上调作用。
- Fig.2f和g分组信息多了IFX，这是TNF的抑制剂，说明TNF对ROCK的上调作用。
- Fig.2h引入了多种抑制剂，在加入了NF-κB的抑制剂后，发现TNF对ROCK2的正向调控作用收到抑制
Fig.3
- 和前面一张图构成了一正一反的对照实验，这里是减少TNF再去检测ROCK2
- Fig.3a和b提示加入了抗TNF的抗体之后，ROCK2的水平显著降低了
- Fig.3c和药物治疗有关，在药物有效组能够观察到TNF和ROCK2之间“你动我也动”的趋势，Fig.3d检测的指标和Fig.3c一样，只不过换了一种方法IHC
- Fig.3e-g的分组发生了变化，加入了ROCK2的抑制剂，加入了抑制剂之后促炎因子IL-1β和TNF的表达降低，抗炎因子IL-10的表达升高，这个结果对治疗是有意义的
Fig.4
- 细胞表型的水平
- 两种方法：ELISA和qPCR，加入ROCK2后，以TNF为主的促炎因子减少，以IL-10为代表的抗炎因子升高
Fig.5
- 开始做下游机制的结果了，ROCK2通过STAT调节了细胞分化
- Fig.3a和b是流式细胞学的结果，Fig.3c-f是对应的柱状图结果，其中设置了几种对应的marker，加入了ROCK2的抑制剂后，Treg细胞增多，Th1和Th17细胞减少，Th2细胞没有显著变化
- Fig.3g-j图中使用了qPCR去检测以上细胞群相关的转录因子，提到的结果和上面的Fig.3c-f是比较一致的
- Fig.3k图观察了p-STAT的表达情况，其中抗CD3和CD28的抗体是T细胞分化的激活剂，当加入了抗ROCK2的抑制剂后，p-STAT5表达增多，p-STAT1/3表达降低，提示ROCK2通过STAT介导了细胞的分化
Fig.6
- 动物实验，ROCK2可以改善小鼠的肠炎
- Fig.6a-f是用药之后来观察小鼠疾病的进展，抑制ROCK2后，疾病活动指数降低，体重升高，病理评分降低，说明药物有效
- Fig.6g是免疫组化的结果，在抑制了ROCK2后，CD4代表的T细胞，MPO代表的中性粒细胞和F4/80代表的巨噬细胞的浸润都减轻了，炎症缓解。
Fig.7
- 还是动物实验的结果，阻断ROCK2可以抑制Th1和Th17细胞的分化
- Fig.7a-c是流式细胞学的结果，抑制ROCK2后Th1和Th17细胞减少
- Fig.7d-k是用qPCR检测相应的炎症因子，抑制ROCK2后，以IFN γ为代表的促炎因子减少，以IL-10为代表的抗炎因子增加
总结
- 优点
- 数据维度充分：四个维度的数据齐了
- 逻辑论证充分
- 缺点
- 没有双操作的回复实验
