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文献一点通 Case 5 miRNA为主的二元变量

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miRNA

文献阅读困难的可能原因

  • 专业英语水平受限
  • 对于文献背后常识和常理的理解不足，常识是指在论证某一科学问题时，所涉及的常见实验方法，明星分子与信号通路。这部份内容可以通过精读领域内3-5篇高分文章获得。当然也推荐大家学习二十四型的课程
  • 本门课程主要负责解决常理问题，就是文章论证的逻辑规律。这门课程的基础是三十六策课程，大家可以在学习这门课程的同时回顾三十六策课程的内容，以三十六策为理论，三十六策为实践。

复习基本的文章论证框架

  • 最简答逻辑结构是单变量的论证，分子-表型-疾病，通常表型和疾病的关系是已知的，所以研究的重点是建立分子和表型之间的关系
  • 对于以分子为主变量的课题，实验设计的十二字原则是“表达差异，正反回复，细胞动物”
  • 在单变量的基础之上，为了提高研究的深度和层次，可以采用表型嵌套的方式来设计课题。
    • 平行嵌套：表型A和B之间没有交互关系，没先后，本质是在单变量的基础上堆砌了多个表型，再加上多株细胞的平行验证，直观上增加了数据量，但是文章的质量并不只取决于数据量的多少
    • 因果嵌套：表型A和B之间具有交互关系，有先后就是因果嵌套，这种设计在文章的数据逻辑深度上更胜一筹。
  • 举个例子：某个分子经由表型A作用于表型B，并介导某种疾病；通常嵌套的表型A和B之间的关系是已知的，比如凋亡和自噬，自噬和耐药等；这种情况下我们可以把表型A视为某种程度上的“伪变量”，单变量的因果嵌套就变成了类似于二元变量的论证结构，相关的论证分为三步
    • 分子调节表型A
    • 分子调节表型B
    • 分子调节表型B依赖于表型A

miRNA论证特点

  • 对miRNA的介绍，详见三十六策 Lesson 4
  • 除了遵循单变量和二元变量的基本论证逻辑以外，miRNA的逻辑论证有独有的特点，这部份内容可以复习三十六策 Lesson 11
  • miRNA研究的优势
    • 在表达差异上，miRNA是非编码RNA，不表达蛋白，所以无需买抗体做western，直接做qPCR就可以了，简化了工作量
    • 在执行“一正一反”的操作时，针对miRNA分子的过表达或沉默操作只需要订购短片段的合成RNA，价格低廉操作方便，无需病毒即可高效转染。
  • 与功能基因研究不同的
    • miRNA gain-of-function（以下写作GOF）的标签被称作mimics，LOF的标签被称为inhibitor
    • 在rescue环节，由于miRNA的作用相对单一/经典，负调节下游靶基因，所以适用的操作是“反正正或反反反”，具体操作内容复习这篇文章
    • 在机制研究方面，miRNA结合靶基因的验证只有一个经典实验，也就是荧光素酶报告基因Luciferase，这个实验本身就是直接作用机制中最容易开展的实验，没有之一
    • 位点验证实验：把miRNA与目的mRNA的3’-UTR区域的位点突变掉，作为一个补充验证

本期介绍的文献


在LncRNA和CircRNA成为科研新宠的当下，科研小白不必跟风买进，选择miRNA作为non-coding RNA的基本款研究，在分子或者机制上抓住创新点，也是不错的选择

补充内容：PI3K-Akt信号通路与自噬的关系

阅读文章的逻辑

文章1

读题目


  • miRNA负调节自噬，因为题目中用到了inhibit这个词
  • 分子+通路的间接二元结构
  • 题目中的in cell 可能提示这篇文章只有细胞和分子水平的数据，没有动物和组织来源的数据。

论证逻辑

Fig.1 & Fig.2

  • Fig.1推测是基础表达的内容，因为在Fig.1a看到了expression；分组：对照+疾病是表达差异的内容，后面还有过表达+疾病，以及过表达对照+疾病，检测的指标都是目标分子的表达差异，所以包含了分子操作的验证内容。
  • Fig.2:细胞表型的结果，主要论证了分子和表型的相关性，符合假设逻辑的内容；Fig.2a-b是电镜观察自噬的结果，可以看到在疾病+过表达miRNA的组，自噬泡形成明显减少了，提示miRNA抑制自噬。Fig.2c-e是使用wb检测自噬相关蛋白，过表达后观察到LC3Ⅱ/Ⅰ的比值下降，提示自噬减弱。

Fig.3

  • 细胞表型的结果，关注的表型是凋亡
  • 自噬和凋亡之间存在很多cross-talk，所以经常会绑定出现在文章中
  • Fig.3a是镜下的细胞形态，在过表达miRNA后，细胞凋亡减少了
  • Fig.3b和Fig.3e-g使用western检测了凋亡相关蛋白，过表达miRNA后凋亡相关分子的表达都减低了，说明miRNA负调节凋亡
  • Fig.3c中检测CCK-8表达，检测细胞增殖表型

Fig.4

  • 间接机制，出现了通路的结果
  • 整个图都在用western检测与PI3K-Akt信号通路相关的明星分子，过表达miRNA后PTEN降低，p-Akt的比例升高，下游分子-磷酸话的p70S6K升高，提示miRNA激活了PI3K-Akt信号通路

Fig.5

  • 间接机制的rescue实验
  • 用到了Akt/mTOR的抑制剂：BEZ235
  • 注意看分组，分组里出现了”+”，这提示可能存在变量的双操作，如果是变量的双操作，这就非常可能是一个rescue
  • Fig.5a：加了抑制剂以后去验证通路的变化，是操作有效性的验证
  • Fig.5d-g进行rescue，然后检测自噬的marker，Fig.5h-g是进行rescue，然后检测凋亡的marker

总结

  • 分子+通路的二元变量结构，做成了平行嵌套，如果能找到自噬的抑制剂，做因果嵌套会更加充分
  • 本文在数据维度方面，只有一株细胞，有分子+通路的间接机制，对于主变量只有单边的过表达操作，没有敲减，没有动物实验，也没有组织标本。

文章2

补充：关于主变量

  • miR-34a，最后的”a”是用来指代：在一些高度同源的miRNA，它们在功能上方式是非常相似的，序列上也只相差了1-2个nt，为了区分这些同源的miRNA，通常就会在第一个发现的miRNA之后增加小写字母进行区分

读题目&论证逻辑

  • 注意关键词：supress和inhibit，揭示了调控关系

Fig.1&2

  • Fig.1有表型和基础表达的结果，此外还看到了mice和cell，所以有动物水平的结果
  • Fig.1a是动物模型的造膜，加入诱导剂LPS引起小鼠的急性肺损伤，并且进行了肺组织评分
  • Fig.1b和d是小鼠组织的相关结果，在ALI动物模型中，LC3Ⅱ/Ⅰ的比值升高，提示自噬激活；并且加入LPS后，miRNA的表达也升高了
  • Fig.1c和e是细胞表型的结果，和前面的结果是一致的
  • Fig.2是细胞表型的结果，论证分子和表型的相关性
  • 看Fig.2的分组：Control，Mimics和Inhibitor，分别代表对照，过表达和敲减

Fig.3

  • 分子调分子，直接机制的研究
  • Fig.3a，操作miRNA，没有看到FoxO3的mRNA表达水平有显著的改变，但是其蛋白水平在B图发生了显著的变化
  • 由于miRNA一般是抑制mRNA基因的表达，这种抑制会产生降解或者阻遏的效应，可以复习三十六策 Lesson 11，蛋白表达降低才是miRNA起效的金标准，miRNA过表达，其靶基因mRNA可能表达降低，也可能变化不显著，但在蛋白水平，都应该表现为明显的降低，无论是哪种机制，蛋白表达降低都是金标准
  • Fig.3上了Luciferase荧光素酶报告基因实验，这个是研究miRNA作用的金标准，miRNA会通过与mRNA的3’-UTR发生结合的方式，阻遏mRNA的翻译过程。突变的时候结合不上了，荧光值就降低了。

    致所有看不懂复杂分组的朋友：（包括智商下线的我自己）
    好脑子不如烂笔头，拿张草稿纸出来画图
    实验设计+分组细节推理原理和结果，慢慢就出来了

  • 在图中，pLu是plasmid Luciferase，wt-wild type野生型，mut-mutation突变体
  • 先看1和2列，都转入了带有野生型FoxO3的Luciferase质粒，1列给了NC-negative control，2列给了mimics，说明高表达miRNA可以抑制FoxO3的转录
  • 总而言之Fig.3是直接机制研究，说明miRNA可以负调控下游的靶基因FoxO3

Fig.4

  • 因变量与表型的关系
  • 在我们的预测之外，大多情况下因变量和表型的关系是有文献报道的，不会需要在文献中单独论证。
  • 继续遵循单变量论证套路，但去掉了表达差异的内容
  • Fig.4a是分子操作的验证，用siRNA干扰了FoxO3后，FoxO3的表达水平下降了，Fig.4b是一样的，只不过是蛋白水平的验证。
  • Fig.4c用siRNA敲减了FoxO3之后，观察自噬明星的表达情况，发现LC3Ⅱ/Ⅰ的比值下降，提示自噬发生减少。

总结

  • 没有设计回复实验
  • 数据维度
    • 一株细胞
    • 分子+分子的直接机制
    • 主变量的正反实验
    • 细胞动物
    • 没有组织标本

文章3

读题目&论证逻辑

  • 题目中的关键词
  • Patients：做了组织标本
  • limit

Fig.1

  • 筛选实验的结果，miRNA expression profile-表达谱，解释了主变量如何发现的问题，通过筛选的方式发现的。
  • 作者收集了Ⅰ型糖尿病患者的淋巴结样本后，分离Treg，检测miRNA的表达
  • Fig.1c是定量的结果，miRNA在疾病淋巴结中显著升高

Fig.2

  • 表达差异的结果，在糖尿病淋巴结高表达，在没有分选的细胞中没有变化，说明miR-125a的表达差异存在于Treg细胞群中。
  • 换了两个细胞来源

Fig.3

  • 直接机制，揭示了作用靶点
  • Fig.3a是IL-6R与miRNA的结合实验，说明这俩有结合；Fig.3b说明FOXP3和miRNA没有结合
  • Fig.3c说明miRNA与TNFR2有结合，Fig.3d说明miRNA可以和CCR2结合，而且可以结合的位点很可能不止一个

Fig.4

  • 流式细胞学的结果
  • Fig.4a说明Ⅰ型糖尿病的淋巴结样本中，CCR2表达降低
  • Fig.4b是miRNA与CCR2的相关性分析，说明是负相关

Fig.5

  • 跑去做了CCR2的配体-CCL2，用来解释CCR2来源的问题
  • 主要用了免疫荧光的方法，Fig.5a疾病组中看到黄色荧光表达增加，说明分泌胰岛素和CCL2的细胞在疾病组中表达增加，而且共定位，提示了这俩分子是一个细胞分泌的
  • Fig.5b是Fig.5a的定量结果
  • Fig.5c是对疾病组的细分化，把疾病组细分为了分泌胰岛素的细胞和胰岛素缺陷的胰岛，在前者中可以看到黄色荧光，后者看不到，说明CCL2是由分泌胰岛素的细胞产生的。

总结

  • 虽然引入了CCL2，但其存在的是用来补充解释CCR2的来源的，还可以归入到对CCR2的论证逻辑里面
  • 在数据维度上，缺了动物实验
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Article table of contents TOP
  1. 1. 文献阅读困难的可能原因
  2. 2. 复习基本的文章论证框架
  3. 3. miRNA论证特点
  4. 4. 本期介绍的文献
    1. 4.1. 补充内容：PI3K-Akt信号通路与自噬的关系
    2. 4.2. 阅读文章的逻辑
    3. 4.3. 文章1
      1. 4.3.1. 读题目
      2. 4.3.2. 论证逻辑
      3. 4.3.3. Fig.1 & Fig.2
      4. 4.3.4. Fig.3
      5. 4.3.5. Fig.4
      6. 4.3.6. Fig.5
      7. 4.3.7. 总结
    4. 4.4. 文章2
      1. 4.4.1. 补充：关于主变量
      2. 4.4.2. 读题目&论证逻辑
      3. 4.4.3. Fig.1&2
      4. 4.4.4. Fig.3
      5. 4.4.5. Fig.4
      6. 4.4.6. 总结
    5. 4.5. 文章3
      1. 4.5.1. 读题目&论证逻辑
      2. 4.5.2. Fig.1
      3. 4.5.3. Fig.2
      4. 4.5.4. Fig.3
      5. 4.5.5. Fig.4
      6. 4.5.6. Fig.5
      7. 4.5.7. 总结
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