- 主要包括药物+通路和药物+分子两种类型
- 主要论证的过程：
- 药物调表型
- 药物调节通路/分子
- 药物调节表型靠通路/分子（回复实验）
- 复习三十六策 Lesson 5的内容，以药物为研究对象的课题只负责回答两个问题，四种类型
- 药物为什么有效？-发现新药/老药新用
- 药物为什么无效？-耐药机制/耐药逆转
- 与分子作为主变量相比，药物作为主变量没有多种多样的变化类型，也不需要制备复杂的操作工具，比研究分子高效不少。
使用的文献：
- IF在3-5分左右，可见药物+分子/通路都可以产生具有机制内容的课题了，在药物或者机制上抓住创新点，跨过3分是可行的
补充知识：自噬表型
- 复习：二十四型 Lesson 5
- 简单po一张图：
复习：文献泛读四步骤
文献1
读题目
论证套路
单变量1：药物与表型的关系
- 药物研究和我们常做的功能基因研究不一样，它没有基础表达和正反回复环节的设计，对于这篇文章来说，首先要摸索药物有效浓度，然后在加药时观察细胞死亡的情况
二元变量：药物通过通路诱导表型，“三部曲”
- 加药观察自噬表型
- 加药观察通路变化
- rescue回复实验：先加药，观察通路和自噬变化，再加药的同时逆转通路，再观察表型
单变量2：自噬与细胞死亡的单变量
- 操作自噬，观察细胞死亡
- （可选）：设计rescue实验，加药的同时逆转自噬，观察表型
Fig.1
- 两张图，横坐标是药物的梯度浓度，纵坐标是细胞活性和BrdU染色实验，典型的增殖表型
- 药物K能够上调细胞活性，尤其是在10和25这两个浓度的条件下
Fig.2
- 药物减轻了棕榈酸诱导的脂毒性，棕榈酸是胰岛β细胞死亡模型所运用到的药物
- Fig.2a：增殖表型，证明加药后细胞活性增强
- Fig.2b-e用到了各种方法检测细胞凋亡的表型，注意Fig.2分组发生了变化，出现了Tem，这个物质是mTOR的抑制剂，可以看作自噬的激活剂
- 注意Fig.2d的分组：PA-疾病组；PA+Tem：疾病+促进凋亡；PA+K：疾病模型下的加药组，可以看到加药之后，一堆促凋亡蛋白表达都下调了，说明加药能够抑制凋亡。
Fig.3
- 自噬的细胞表型
- Fig.3a：免疫荧光观察自噬体的荧光，荧光共定位越多说明自噬越强
- Fig.3b：PCR检测加药后的自噬，发现加药后自噬增加
Fig.4
- 自噬的细胞表型
- Fig.4a：免疫荧光检测LC3，自噬过程中LC3会发生聚集，从胞浆转位到胞膜，在荧光显微镜下会形成明亮的绿色荧光斑点
- Fig.4b：Western检测自噬相关的蛋白情况，说明了加药能够激活自噬
Fig.5
- 加自噬抑制剂，做rescue
- 荧光观察自噬体的结构
Fig.6
- 加自噬抑制剂，做rescue
- 电镜观察自噬体的结构
Fig.7
- 加自噬抑制剂，做rescue
Fig.8
- 观察PA和PA+K，加入研究药物K后观察到LC3转位到细胞膜，激活了自噬
- 观察PA+K和PA+WT+K，可以发现加入自噬抑制剂后，自噬减弱了
Fig.9
- 间接机制，药物通过AMPK/mTOR通路介导自噬
- 引出了通路，间接机制的研究
- AMPK是mTOR通路的抑制性分子，在细胞能量不足时被激活（AMP dependent kinase），可以拮抗mTOR分子的活性
- 在Fig.9a和b当中，加药可以导致p-AMPK表达升高，p-mTOR表达降低
- Fig.9c在加药的同时引入了AMPK抑制剂c.c.，观察自噬相关标志物，这就是rescue了，由于药物本身上调AMPK信号通路，激活自噬，所以回复策略是“正正反”
- Fig.9d引入了AMPK的siRNA，这又是一个rescue实验
- 一个阅读本图中各种复杂柱状图的策略：（以Fig.9c为例）
- 首先观察左边的PA+c.c.-K0（理解为什么都不加的对照组）和PA+c.c.-K10（只加了药），观察到p-AMPK表达升高，p-mTOR表达降低，以及自噬标志物LC3-Ⅱ表达升高，提示自噬发生增加
- 接着观察Pa+c.c.-K10（只加了药）和最右边的PA+c.c.+K10（又加药又加抑制剂），观察到自噬标志物LC3-Ⅱ表达减少，提示自噬发生减少
Fig.10
- 加入AMPK抑制剂，用免疫荧光观察表型，还是rescue的思路。
- 观察了自噬体结构以及LC3的表达情况
Fig.11
- 抑制自噬，观察药物对细胞的保护作用是否存在，rescue又来了，不过和前面的rescue设计思路并不相同，这里论证的是药物通过激活自噬，减少凋亡的过程
- 作者加了各种自噬抑制剂WT、CQ、c.c.，以及siATG7，观察增殖和凋亡表型，由于药物和药物和自噬是正调节的关系，所以回复策略还是“正正反”
Fig.12
- 做了原代细胞的培养，验证前面细胞系的结果
- 也设计了两个rescue实验，分别是加药抑制自噬观察凋亡 ，加药的同时抑制AMPK观察自噬
- 总而言之，这张图证明了药物通过AMPK介导自噬，保护大鼠的胰岛细胞
小结
- 作者主要论证的是药物+通路的二元变量结构，其中有表型的因果嵌套
- 药物通过激活AMPK抑制自噬，最终减少胰岛β细胞的凋亡
- 文章主要的创新点在药物上，通过找到了药物下游的通路，回答了药物为什么有效的问题
- 论证关系如下图所示
- 在数据维度方面，文章缺少组织和动物水平的数据
文献2
- 自噬和凋亡经常出现因果嵌套，绑定出现在文章之中。
- 题目中的in vitro和in vivo提示了有细胞和动物水平的数据
论证套路
单变量：药物和凋亡
二元变量：药物通过Beclin-1介导自噬
单变量：自噬与凋亡
Fig.1
- 加药抑制细胞增殖
- Fig.1a-b，横坐标是药物浓度，纵坐标是细胞活性，这是在两个乳腺癌细胞系上，用CCK-8检测细胞活性的结果
- Fig.1c是克隆形成实验的结果
Fig.2
- 检测凋亡的细胞表型
- Fig.2a是流式细胞学的结果，随着药物浓度的升高，细胞凋亡显著增加
- Fig.2b检测了几种与细胞凋亡相关的marker，其中以Cleaved PARP为代表的促凋亡蛋白在加药之后增加了
- 总之，流式和凋亡的结果都支持加药诱导凋亡的论点
Fig.3
- 加药抑制自噬
- Fig.3a用免疫荧光检测明星分子LC3的表达情况
- Fig.3b用WB检测自噬相关biomarker，随着药物浓度增加，Beclin-1的浓度显著降低，说明加药抑制了自噬的发生
Fig.4
- 药物依赖自噬介导凋亡——rescue实验，考虑到自噬和凋亡的上下游调控关系是相反的，这里采用“反正正”的策略
- Fig.4a和4b是细胞增殖实验的结果，Bec+Can-5是加药的同时过表达Beclin-1
- Fig.4c和4d也是rescue，同时操作药物和下游分子，观察自噬和凋亡的表型
Fig.5
- 动物实验的结果
- 部份实验组同时操作了药物和下游分子，观察肿瘤体的大小和凋亡表型，进一步论证药物通过自噬影响凋亡的结果
总结
- 作者主要论证的是药物+分子的二元变量结果，其中还有表型的因果嵌套
- 文章的论证逻辑如下，和上一篇文章基本是一致的
文献3
论证套路
Fig.1
- 一张图，给了药物的分子结构，分子式、分子量
- 一般来说新药/新提取出的有效成份，都得这么来一通
Fig.2
- 药物与表型（关节炎）之间的关系
- 动物模型，药物可以改善关节炎的症状
- Fig.2A和B：加药组/对照组，横坐标是关节炎指数和发病率，加药组的这俩指标都低于对照组
- Fig.2C和D：HE染色和microCT分析了药物对关节炎的影响
Fig.3
- 动物实验，加药对体液免疫和细胞免疫的影响
- Fig.3A 加药以后，发现IgG的量下降了，说明影响了体液免疫
- Fig.3B collagen Ⅱ是用来造关节炎模的药物，造模成功后，观察到增殖细胞降低了，说明药物不仅影响体液免疫，还影响细胞免疫
- Fig.3C用ELISA检测了与T细胞分化有关的各种细胞因子，在加药之后IL-17和IL-6显著降低了
Fig.4
- Fig.4A：流式检测了IL-17和CD4，这俩分子标志物都阳性的细胞就是Th17细胞，在加药后，Th17细胞显著减少了
- Fig.4B用PCR检测了4种RNA的相对水平，这4种RNA对应的表达产物都是促进Th17细胞的分化的，可以注意到在加药后4种分子的量都显著降低了
- Fig.4C在造模后加药，检测IL-17的含量
- Fig.4D、E和Fig.4A没有显著不同，都是在加药后检测Th17细胞群，但是区别在于样品来源不同
Fig.5
- 做的和Fig.4差不多，都是用流式细胞学、qPCR和ELISA去检测相应的细胞群和细胞因子
- 注意的是分子标记的变化，CD25和FoxP3双阳性的细胞是Treg细胞群
Fig.6
- 文章是有机制的，靠上的是明星通路JAK/STAT
- 检测了一些明星标志物，发现p-STAT5显著增加了，说明激活了STAT通路
总结
- 没有规范的论证逻辑，缺rescue实验
- 主要的创新点在药物，回答了药物为什么有效的问题
