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自噬是近年来的研究热点，耐药和自噬是比较经典的表型
Intro：复习Case 1的内容
- 友情链接
- 第一篇文章：EMT和肿瘤侵袭、转移这三个表型之间是存在因果关系的，可以把这篇文章视作因果嵌套；EMT本身就是肿瘤侵袭、转移的子标签
- 第二篇文章：DNA损伤和细胞凋亡这两个表型是平行关系
- 第三篇文章：EMT和肿瘤侵袭、迁徙在这里是因果关系
当文章中出现两种以上表型的时候，要注意区分这些表型之间是平行关系，还是因果关系
不同的表型类别在论证时，是有区别的
表型嵌套简介
- phenotype crosstalk
平行嵌套
因果嵌套
- 比如用凋亡/自噬去解释耐药，那么凋亡/自噬和耐药之间就存在了因果关系
- 复习三十六策 Lesson 1的内容，因果嵌套相比平行嵌套，是更加受到科研人士喜欢的设计，因为提升了故事的层次感；平行嵌套只是增加了工作量，在思维深度上没有明显的加分
自噬的背景知识介绍
- autophagy
- 2016年诺贝尔生理学或医学奖
- 细胞通过“自己吃自己”，实现废物再利用的过程
- 自噬具有“双向性”，正常条件下，细胞的生长需要自噬来清除垃圾，在应激状态下，自噬也可以导致细胞出现病理性的改变，所以这种平衡的调控非常重要
- 自噬是一个百搭表型，和多种疾病的多个表型有相关性，可以说是某种程度上的“万金油”
自噬过程介绍
- 细胞发生自噬时，首先形成囊泡样双层膜结构/自噬前体，之后自噬前体的双层膜结构不断向两侧延伸，包裹细胞垃圾，逐渐出现隔离膜；隔离膜进一步包裹细胞内的货物垃圾，形成密闭的囊泡，称为自噬体
- 自噬体与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，最终自噬体内的“货物/垃圾”被溶酶体降解，产物小分子回收利用
自噬相关的“明星分子”
LC3
- 全称微管相关蛋白轻链3，也就是microtubule associated protein light chain 3
- 可以分为胞浆型的LC3-Ⅰ和膜型的LC3-Ⅱ，自噬发生时胞浆型的LC3-Ⅰ可以酶解掉一小段多肽，转变成膜型的LC3-Ⅱ，因此二者的比值水平可以用来估计细胞内自噬水平的高低
Beclin 1
- 上调Beclin 1的表达能够促进自噬的发生，而抗凋亡蛋白Bcl-2可以与Beclin 1结合，抑制细胞自噬的发生，所以凋亡和增殖有cross-talk
复习：文章泛读的四要素
文章1
- 文章题目中没有机制，读了abstract也没有，再加上文章可怜的影响因子，只能考虑是没有机制的了
- 由于没有机制，文章的工作量没有特别大
- confer的意思是授予，这个词明确提示“自噬授予了对吉西他滨耐药”，所以我们可以判定这是一篇因果表型嵌套的文章；相对地，平行表型大多数使用的是”add”这个词
反推假设
- 需要论证目标分子HMGB1，表型自噬和耐药三者之间，每两个的关系，也就是HMGB1-自噬，HMGB1-耐药，自噬-耐药
- 自噬与耐药之间的相关性比较容易阐述，前人的报道有很多了，在这篇文章里体现出来，加药看自噬marker就可以了
读图片
Fig.1
- 看FigureLegends：细胞加药可以诱导自噬，是细胞表型，做药物与耐药之间的关系的
- Fig.1A：量效曲线，一般做耐药标配的图，既说明细胞会产生耐药，又可以摸索合适的药物浓度，方便后续的实验设计，用到的检测方法是CCK8
- 补充：恰当的药物浓度：指的是生长抑制率达到50%，所对应的药物浓度就是最佳的药物浓度，称为IC50
- Fig.1B：用western检测自噬相关蛋白水平，分组是对照和加药，SQSTM1又称为p62，在自噬时降低
- Fig.1C：基本同Fig.1B，不同的是换了几个marker，这些marker在自噬时升高
- Fig.1D：Fig.1C的qPCR检测mRNA水平
Fig.2
- 细胞水平的实验，正反回复
- 药物诱导的HMGB1促进细胞自噬
- Fig.2A-B：加入不同药物浓度的药物后，观察目标分子HMGB-1的表达
- Fig.2C：分组是对照和敲减，检测自噬相关的marker
- Fig.2D：分组是对照和过表达，检测自噬相关的marker
- Fig.2E-F：rescue实验，纵坐标是自噬相关marker的mRNA水平，横坐标是敲减+加药
Fig.3
- 仍然是一个细胞表型的实验
- Fig.3A：纵坐标是细胞存活率，依然是用CCK-8，分组是对照和敲减，敲减以后对药物的敏感性显著增加了
- Fig.3B：分组改成了对照和自噬抑制剂MA，其他同Fig.3A
- Fig.3C-D：典型的流式结果，用来检测细胞凋亡，D图分组是敲减+对照，还有对照+自噬抑制
- 小结：Fig.3A-B看细胞生长，Fig.3C-D看细胞凋亡，主要论证的是HMGB-1介导自噬
总结
- 单变量的因果嵌套表型
- 有正反回复，一株细胞，没有机制研究
文章2
- 标题中出现了关键词regulating，提示可能是因果嵌套的单变量研究
反推假设
- 可能的实验设计
读图片
Fig.1
- Fig.1A：细胞存活率为纵坐标，用MTT法检测，S是敏感组，R是耐药组，同一个细胞系来源的两个不同的细胞株
- Fig.1B：qPCR，检测ABC家族的一堆蛋白，结果只有ABCB4是有差异的，在耐药中低表达
- Fig.1C：western的验证结果
- 总结：表达差异
Fig.2
- 细胞水平的敲减实验，“正反回复”
- 选的细胞系是HCT8S，因为在Fig.1里，这个细胞高表达了ABCB4
- Fig.2A：检测细胞生存，看看敲了ABCB4之后加药，会不会出现耐药的现象，检测方法是MTT
- Fig.2B：克隆形成实验，其他同
- Fig.2C：流式检测细胞凋亡，加药+敲减的分子显著降低
- Fig.2D：western检查凋亡相关的marker
Fig.3
- 和Fig.2一模一样的实验设计和分组，除了实验组换成了在Fig.1中低表达目标分子ABCB4做过表达的以外其他都一样
Fig.4
- Fig.4A比较的是正常组织和肿瘤，Fig.4B是原发和继发肿瘤的差异
总结
- 耐药一般通过检测增殖和凋亡，所以索性就一起看了
- 细胞和临床分析，没有动物，没有机制，没有rescue实验
文章3
读题目
- inhibition：可能只有单边操作
- and：可能是平行的表型嵌套
- models：可能与动物
反推论证逻辑
读图片
Fig.1
- 临床样本的结果，“表达差异”
Fig.2
- 细胞水平的结果“in vitro“
- Fig.2A：针对DDR1的基因操作工具验证
- Fig.2B：用ELISA检测Aβ，Aβ这个蛋白是神经退行性疾病的biomarker，在细胞系里加入Aβ造模
- Fig.2C：实验方法是一样的，但是分组换成了加入DDR抑制剂厄洛替尼，DDR抑制剂+干扰DDR的表达可以有效减少Aβ蛋白
- 注意，Fig.2C不是rescue实验
Fig.3
- 细胞表型的敲减实验
- 敲减了DDR可以抑制细胞的死亡
Fig.4
- mouse models-动物水平
- Fig.4A：用western检测与神经病变有关的蛋白表达
- Fig.4B-C：用ELISA检测可溶和不可溶的Aβ水平
- Fig.4D-E：用ELISA检测p-Tau和caspase，用来检测大脑的功能
Fig.5
- 换了一个动物模型进行的二次验证
Fig.6
- 注意看FigureLegends，关键词cytokines and chemokines——炎症表型，最重要的是M图的一堆物质的水平
总结：平行嵌套
