外泌体-miRNA研究套路 Lesson 9 外泌体分离方法解析

TIP

这些是本篇文章的标签，来发现更多感兴趣的内容吧
科研
解螺旋
套路课
miRNA
外泌体

使用的文献：Hypoxic lung cancer-secreted exosomal miR-23a increased angiogenesis and vascular permeability by targeting prolyl hydroxylase and tight junction protein ZO-1

• 在这一节课的内容里，我们将对各种外泌体分离方法的优缺点加以总结，方便小伙伴们在日后的实验中选择最合适的。
• 外泌体是一种由细胞分泌到外环境，负责细胞间通信的微小囊泡；根据条件，选择适合的方法，将外泌体从培养上清、血液、尿液以及乳汁等等生物体液中分离出来，是我们在这一节要讲解的内容。

外泌体的分离方式

各种分离方式简介

在我们这篇文献当中，应用的分离方式是第四类，是基于聚合物，也就是PEG沉淀的方法，采用的是THERMOL的试剂盒。

最经典：差速离心的方法

• 这种方法的机制是利用超离的离心力把外泌体沉淀下来。这个方法是目前发表文献中应用最多的，大概可以占到一半以上。采用这种方法，最大的缺点是对血浆这种粘稠的液体分离效果不佳。

密度梯度离心法

• 利用碘克沙醇等配置不同密度的溶液，利用密度梯度将外泌体悬浮在和它相等密度的液体层里。
• 这个方法的优点是外泌体的纯度非常高，目前的高分文章，尤其是下游实验对外泌体的纯度要求比较高时，这个方法是非常好的选择。

膜超滤法

• 利用过滤或者排阻层系的方法，原理主要是基于外泌体的直径大小把它分离出来。
• 老师觉得它最大的优点是不需要超离，但是它的技术要求相对比较高，而且也无法排除与外泌体大小相近的颗粒等等。

基于聚合物的沉淀

• 市场上商业化的试剂盒提供的方法，利用聚合物沉淀的方法。
• 优点同样也是不需要超离，操作比较容易快速；但是最大的缺点就是非外泌体材料的污染，而且纯度非常低，容易干扰下游实验。

利用免疫学技术分离

• 利用特异性抗体磁珠结合外泌体，将其选择性分离出来。得到的外泌体可直接用于分析DNA或者总RNA的分离，但这个方法最大的缺点是不适合大量的样本，而且可能会造成外泌体功能的失活。

各种分离方法之间的比较

• 在这里推荐一篇论文
  
• 上图是分离方法的流程图，我们看到这篇文章用到了四种分离方式，包括了超离，密度梯度离心，以及两种试剂盒的方式。
• 我们先看上面它采用的样本，样本是细胞的培养上清，这种细胞培养上清是采用0.5%去除外泌体的血清培养剂，培养24小时以后收集的，细胞的活率是要大于95%的。
• 收集好培养上清以后，我们就要对培养上清进行处理，在这里作者采用的是膜过滤加超滤的方式。

膜过滤+超滤

• 首先我们要对培养上清中的悬浮的细胞进行处理，我们要去除悬浮细胞，采用的方式是200g离心。
• 第二步就是要用0.45微米的滤膜过滤，去除培养上清当中的细胞碎片。
• 接下来，很关键的一步是用10KD的超滤管进行超滤浓缩；在这里要分享一下，如果我们培养上清当中还有血清，那可以考虑采用100KD的超滤管进行过滤，这样的话可以能够去除一部分培养上清当中血清的杂蛋白。
• 最后一步，作者采用的是0.2微米滤膜的过滤，可以有效的去除这种大的颗粒的影响。
• 总结来说作者的这种膜过滤的方法还是非常值得推荐的，尽管这种方法可能会损失一部分粘在膜上的外泌体，但是对我们后续的分离帮助还是非常大的，可以有效的去除大的颗粒和蛋白杂质。可以有效的减少后续实验的样本量，提高我们的产量。

差速离心的方法

• 经典的差速离心方法是采用不同的转速去除悬浮细胞、死细胞以及细胞碎片。
• 这篇文章中，作者采用了膜加超滤的方式，去图袋这种反复离心的方法，既节约了时间也提高了效率
• 经典的差速离心方法超离一遍以后，细胞是要经过PBS的洗涤的；这里分享一下经验，PBS洗涤确实能够有效的去除粘附在外泌体上的一些杂蛋白，但是同样PBS洗涤也会造成外泌体的大量的损失，而且经过测算，损失的效率大概能够达到30%以上，大家可以根据实验的需要来选择。

密度梯度离心

• 如果我们的实验对外泌体的纯度要求比较高的时候，密度梯度离心就非常必要了。
• 它的原理是制造出不同密度梯度的介质液，使外泌体停留在和它密度相同的介质液层面里；最常用的介质液是碘克沙醇，可以自行配置，也可以买Sigma配置好的介质液，商品名OptiPrep。
• 我们可以配置不同浓度的碘克沙醇蔗糖溶液，对应着不同的密度；外泌体是囊泡结构，它的密度在1.13到1.19之间，与脂蛋白普通的蛋白或者核酸不同，利用密度梯度就可以把外泌体和其他杂质轻易的分开。但是外泌体可能是由于来源细胞的不同，造成密度有轻微的波动；包括我们在配置梯度液的时候，外泌体的密度也会有轻微的不同，所以我们都要做预实验，摸索出外泌体到底是在哪一层，后续实验我们直接吸取那一层的外泌体即可。
• 吸取外泌体后，如果蔗糖和碘克沙醇不影响下游实验，可以不去洗涤，否则则需要再经过超离洗涤下来。
• 这个方法的优点是纯度非常高，缺点是对技术要求也非常高。

PEG沉淀的方法

• 目前市场上采用比较多的是SBI的ExoQuick，和ThermoFisher的Total Exosome Isolatio这两个试剂盒。这两个试剂盒的原理都是相同的，都是利用PEG，也就是聚乙二醇沉淀。
• PEG最早是由于细胞融合的，沉淀外泌体的原理是PEG可以抓取亲脂性的物质。PEG把亲脂性的物质聚集在一起，形成比较大的沉淀团，这个沉淀团采用低速离心就可以把它沉淀下来，因此如果采用PEG沉淀的话，我们就会看到非常大，非常明显的白色沉淀。如果我们采用超离的方式是看不到沉淀的，即便看到也是半透明的极小的颗粒。
• 这个明显的白色沉淀里混杂有各种各样的亲脂性蛋白、核酸、以及PEG等等。这些杂质会跟随我们后续的实验，影响了我们的实验结果，这也是这个试剂盒分离的最大的缺点。
• 在目前发表的文章中，有大概10%的文章采用了这种分离方式，但是现在也确实有这样趋势，文章发表的IF越高、档次越高，也就越多采用这种密度梯度离心的方式，而且最近采用这种试剂盒沉淀得到外泌体所做的文章，也有Review会提出要用差速离心的方法进行对比，看是否能得到相同的结论。

另一篇介绍各种分离方法差异的文章

• 上图也是一篇关于外泌体分离方式对比的文章，我们可以看到：差速离心和PEG沉淀的方法得到的外泌体的杂质比较多，尤其是PEG的方式；而密度梯度离心，无论是蔗糖重水还是碘克沙醇，都能得到相对比较纯净的外泌体，而且我们发现点克沙醇的产率也相对会高一些

免疫分离的方法

• 在这里举例的是ThermoFisher免疫磁珠的方式，这个方法比较简单，不需要超离，1个小时就可以完成，目前在外泌体亚类的研究也非常热门。
• 利用这种方式可以根据实验需要，分离出表达不同标志的外泌体的亚类，有ThermoFisher提供的商品化的试剂盒。

总结

我们可以根据自己的实验需要进行选择,不一定就非要选择其中一种,可以根据自己的实验需要将两种综合起来使用。
没有最好的分离方法，只有最适合自己实验的分离方式。

外泌体分离实验流程

样本的收集与保存

• 首先，让我们先来说一下外泌体样本的收集与保存。为了方便讲解，我们把它分为两个大类，一类是培养上清，一类是血浆尿液等等生物体液。

培养上清

• 培养上清最大的优点是不受样本量的要求，而且取样比较方便
• 但是，它在收集过程中，我们还是需要注意几个问题
  • 第一是污染，有污染的样本是肯定不能收集的；在这里要注意一点，我们在做一些特殊的细胞样本是带有病毒基因组的，在培养过程中可能会释放一些病毒颗粒，这些病毒颗粒的大小与外泌体类似，对我们后续外泌体的分离会造成影响的，所以我们在进行外泌体分离的时候一定要注意这一点。
  • 培养时间：一般的培养时间是12到48个小时，因为12到48个小时细胞就会有外泌体释放出来，但是在一些特殊药物处理的情况下，细胞可能会在更短的时间，就释放出外泌体。
  • 细胞活率：一般情况下细胞的死亡率是不能超过5%的，也就是细胞的活率要大于95%。因为细胞死亡后会释放出各种小体，影响我们的下游实验研究。
  • 非常重要的血清的问题：如果细胞可能够耐受的，可以选择无血清的培养剂；如果细胞不能耐受，那也一定要选择去除外泌体的血清；这种去除外泌体的血清可以买到商品化的，也可以自己来制作。

生物体液类样本

• 我们先来说一下最常用的血液：
• 我们知道血液可以分离出血清，也可以分离出血浆，一般情况下血浆样本会更为合适，在凝血过程中血小板会分离出大量的外泌体，干扰我们的实验结果；不过如果我们要是研究和血小板相关的疾病的时候，血清可能更为合适。
• 针头的大小：有一些文献报道说，21号针头可能会更适合一些。
• 采血时间，采血的位置以及生理周期等等：在收集样本的时候，我们应该尽量做到一致。
• 样本的处理时间：我们应该在采血后三十分钟之内处理好样本，因为血液中的白细胞、血小板等会分离大量的外泌体。
• 外泌体的保存：一般分离好的外泌体，我们会用PBS溶解；如果我们下一步是为了分离外泌体内的RNA等等。我们可以直接把外泌体溶解在Trizol等裂解液里，保存方式一般都是低温保存。
• 有一些文献报道，长期的低温保存会对外泌体造成影响，尤其是冻融的影响，在这里我们要根据下游实验的使用时间来进行选择保存方式；如果我们几天内就使用的话，可以放在4°C里，以防止冻融造成的影响。如果我们是分批次收集外泌体，分批次进行实验的话，最好是所有的外泌体都经过同样的处理，同样的冻存方式，以保持我们实验的平行性。
• 我们进行电镜或者粒径检测外泌体的时候，冻融会造成外泌体的粘连。所以我们在进行电镜或者粒径检测的时候，一定要使用新鲜分离的外泌体。
• 外泌体的保存：我们要分装保存外泌体