使用的文献：Hypoxic lung cancer-secreted exosomal miR-23a increased angiogenesis and vascular permeability by targeting prolyl hydroxylase and tight junction protein ZO-1
- 在上一节内容中，我们介绍了miRNA的研究简史，miRNA的命名规则，生物学合成过程以及降解过程等基础性的内容。在本节内容中，老谭将进一步介绍miRNA的细胞学功能和miRNA在疾病中的相关研究和应用。
- 在植物细胞内，miRNA通常都可以和靶基因mRNA的序列之间形成序列上的完美匹配，但是在动物细胞内，miRNA和靶基因mRNA之间通常并不是完美匹配，而是部分匹配，只需要有7~9个碱基的匹配即可。因此，一个miRNA分子可以影响下游很多的mRNA；反之，一个mRNA也可以受到很多miRNA的调控。miRNA与mRNA之间的调控关系网络极为复杂，也正是因为如此，miRNA几乎参与了所有重要的细胞学功能。
miRNA的细胞学功能
miRNA调控细胞的分化和发育
- 我们首先介绍miRNA调控细胞的分化与发育。
- 通过基因突变、基因消除和转基因等研究方法发现，很多miRNA分子对控制细胞分化、器官形成和生物体发育等过程都起到了十分重要的作用。
- miRNA影响生物发育的最初证据来源于对线虫发育进程的研究，在线虫幼虫的发育过程中，miRNA-lin4发挥着重要的时间控制作用，其中lin4的两个重要靶基因分别是lnc-14以及lin28，它们编码的蛋白分别调控线虫从L1期向L2期转化，以及线虫从L2期向L3期的转化。lin4基因缺失或者基因突变可以阻止幼虫特定细胞的分化。
- 另一个miRNA分子Lat7和lin4具有类似的功能，同样参与线虫发育的时续调控。
- 在哺乳动物中，miR-181a在调控B淋巴细胞的分化方面发挥重要的作用，同时它也参与了T细胞的发育。
miRNA调控了细胞的增殖
- 有研究发现，在分化培养基中，miR-1能在体外培养的成肌细胞中过表达，从而抑制了细胞增殖，并促进了细胞的分化。与此相类似，在心脏的发育过程中，过表达miR-1也能抑制细胞增殖，从而使得心室壁变得更薄。
miRNA调控细胞凋亡
- 细胞凋亡是由基因控制的，细胞自主的有序性死亡，是有机体用来维持内环境稳定的重要方式。在线虫和果蝇等模式生物中，科学家们发现miRNA能够调控很多细胞凋亡的信号通路。
- 比如，在果蝇中，miR-14突变体能够提高凋亡因子细胞凋亡蛋白酶drice的基因表达水平。drice基因编码的蛋白质能够调控细胞凋亡和脂质代谢，miR-14能够作为细胞死亡的抑制剂，它的过量表达会抑制细胞的死亡。
- 另外，也有研究发现，抑制miR-1d、miR-7、miR-148、204、210、216、296等。抑制了这些miRNA分子的表达之后，能够明显提高细胞凋亡蛋白酶Caspase-3的活性；而抑制miR-214的表达，则会显著降低Caspase-3的活性。
- 还有研究发现，miR-29能阻止细胞凋亡的开启，并且在某些神经退行性疾病，如老年痴呆症、亨廷顿舞蹈病等病症当中，进行的短期给药实验中，展示出显著的疗效。
miRNA在细胞内的失调是导致很多疾病发生的原因之一
- 在几乎每一种疾病当中，都可以观察到miRNA的作用。研究发现，在疾病发生、发展的过程当中，miRNA分子既可以起到促进疾病发生的作用，也能起到抑制疾病发生的作用。
- 我们以肿瘤为例，在几乎所有的肿瘤类型当中，都能观察到miRNA参与其中。miRNA分子既可以发挥类似于癌基因的作用，也能发挥类似于抑癌基因的作用。由于miRNA分子通过结合到下游靶基因的3’UTR区域，并抑制下游靶基因的蛋白表达。因此，miRNA在肿瘤发生和发展过程中，所发挥的具体功能和作用，主要是由miRNA下游靶基因所处的信号通路所决定的。
- 历史上第一个被证实的与miRNA调控紊乱相关的疾病是慢性淋巴细胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia,CLL)。
- 在恶性的B细胞中，miRNA参与调控并介导了B细胞的很多重要的发育过程和功能，例如B细胞受体信号(B-cell receptor signaling)，B细胞的迁移和黏附，在免疫过程中的细胞和细胞之间的相互作用，以及免疫球蛋白的产生和类别转换。miRNA分子除了参与调控和B细胞发育相关的功能之外，还影响了B细胞成熟过程，参与调控边缘区B细胞、滤泡B细胞、血浆B细胞和记忆B细胞的产生过程。
- c-Myc是一个非常著名的癌基因，在很多种肿瘤类型当中都能检测到它的突变。在小鼠体内过表达c-Myc之后，研究人员发现c-Myc能促进很多miRNA分子的表达，在这些miRNA分子中也包括了miR-17-92基因簇。
- c-Myc和miRNA分子同时表达升高后，能显著影响白血病的发生和发展过程。在过表达了c-Myc的淋巴瘤小鼠动物模型当中，过表达了miRNA之后，这些miRNA分子包括miR-150、155、21、34A、17-92基因簇、15-16基因簇，可以使小鼠在很短的时间内发病并很快发生死亡现象。相反，miRNA未发生过表达的小鼠可以持续存活很长的时间
- 还有研究发现，在基因组的miR-17-92基因簇附近，插入一个病毒的基因组序列，可以过度激活miR-17-92基因簇的表达并导致白血病的发生。
- E2F1是E2F转录因子家族的一个成员，E2F转录因子家族在调控细胞增殖和细胞周期的过程中发挥了重要的作用，被认为起到了抑癌基因的功能。
- 在白血病发生过程中，研究发现miR-17-92基因簇中的两个成员miR-17和miR-20a直接作用于下游的靶基因E2F1，抑制了E2F1的信号，从而促进了白血病的发生。
- 因此，有研究者提出了Myc-miR-17-92-E2F转录假说，该假说认为细胞内由于Myc基因的突变，导致miR-17-92基因簇过表达，miR-17-92基因簇中的miRNA分子表达升高之后，可以直接降解下游靶基因E2F1，从而抑制E2F1的抑癌基因作用，导致细胞增殖和细胞周期紊乱，最后导致了白血病的发生。
miRNA参与诸多信号通路的调控
- 之前已经提到，miRNA分子发挥作用的机制是结合到下游靶基因的3’-UTR区域，抑制下游靶基因的蛋白表达。
- 因此，miRNA在肿瘤发生和发展过程中，所发挥的具体功能和作用，主要由miRNA下游靶基因所处的信号通路决定。
- 在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要功能的信号通路非常多，肿瘤中常见的信号通路就有：PI3K-Akt信号通路、NOTCH通路、Wnt通路、JAK/STAT通路、TGF-β通路、DNA损伤修复通路等等。我们以DNA损伤修复通路为例，说明miRNA发挥作用的机制。
- 在正常细胞内，如果出现DNA修复机制的障碍，会导致细胞内DNA损伤和突变的积累，从而导致正常细胞的癌变。因此，DNA损伤修复机制功能的紊乱，是导致肿瘤发生的最重要的原因之一。miRNA分子同样可以通过调控DNA损伤修复机制中的关键基因，从而参与介导肿瘤的发生。
- miRNA调控DNA损伤修复机制的途径有两种，分别是直接调控的方式和间接调控的方式。
- 有很多的研究都发现，miRNA分子可以直接抑制DNA损伤修复基因的表达水平，例如在散发性结肠癌中，miR-155表达升高，从而直接抑制了DNA损伤修复基因MLH1的表达，导致DNA损伤修复机制的紊乱。另外，在胶质母细胞瘤组织中也发现miR-181表达升高之后，通过与DNA损伤修复基因MGMT的mRNA3’-UTR区域结合，抑制了MGMT的表达水平，导致恶性肿瘤的发生。
- miRNA调控DNA损伤修复基因的第二种途径是间接调控。HMGA是一类大约含有100个氨基酸的多态，它含有多个AT-HOOK结构域，HMGA能结合DNA的小沟，从而影响染色体的结构，并导致下游基因转录的变化。
- 在正常的成体组织内，几乎检测不到HMGA的表达；但是在肿瘤发生时，HMGA的表达水平会急剧升高。已经证实HMGA1可以结合到DNA损伤修复基因BRCA1的启动子区域，并抑制BRCA1的表达；HMGA2也可以结合到DNA损伤修复基因ERCC1的启动子区域，同样抑制ERCC1的表达。
- 总结一下，肿瘤发生的一个很重要的机制就是细胞内HMGA1和HMGA2表达升高，随后在HMGA1和HMGA2表达升高之后，这两个分子通过分别结合到下游BRCA1和ERCC1的启动子区域，抑制这两个DNA损伤修复基因的表达，从而导致细胞内DNA损伤修复功能的紊乱，最终导致细胞癌变。
- 有研究证实：多个miRNA分子可以调控HMGA1和HMGA2的表达，这些miRNA分子包括miR-15，16，26A，196A以及Let-7A；临床组织样本检测也证实，在肿瘤组织内这些mRNA分子的表达显著降低，相反，这些miRNA分子的下游靶基因，也就是HMGA1和HMGA2的表达则显著地升高
- 所以，在肿瘤发生过程中，miRNA分子首先表达降低，随后才导致HMGA1和HMGA2表达升高，最终通过抑制DNA损伤修复基因BRCA1和ERCC1的方式，促进了肿瘤的发生。
miRNA的应用
- miRNA的研究成果已经开始应用于临床，并取得了非常好的效果。
早期筛查
- miRNA可以在细胞内合成并且被转运到细胞外，进入血液循环系统。因此，在临床应用中通过检测血浆内的miRNA分子，来预测疾病的发生和发展是非常重要的应用方式。
- 有一项研究通过检测血浆中miRNA的表达谱的变化，筛查早期的结直肠癌患者。研究人员通过miRNA表达谱变化分析，发现早期可切除的二期结直肠癌患者的血浆miRNA表达谱和健康人的miRNA表达谱有显著的差异；因此，此类mRNA表达谱的变化差异可以从正常人群当中筛选出早期可切除的结直肠癌患者，并达到了比较高的准确性和特异性。
作为预后的marker
- miRNA的表达也同样和肿瘤的预后密切相关，在非小细胞肺癌NSCLC当中，研究发现低表达miR-324a的肺细胞往往预后较差
- 在结直肠癌患者体内，高表达miR-185且低表达miR-133b和肿瘤的转移以及较差的预后密切相关
- miRNA分子中有一类特殊的分子，被称为Cell-free的miRNA，也就是循环miRNA分子，这类miRNA分子由肿瘤细胞所分泌，并且可以在血液中高度稳定地存在。这类循环miRNA分子在癌症的发生发展过程中被过度表达和激活，而且这些分子可以通过诊断实验室进行定量检测
- 在霍奇金淋巴瘤当中，血浆miR-21，494，以及1973有望成为对于疾病反应性评估的生物标志物
- 循环mRNA还可以帮助临床进行诊断，或者是成为肿瘤转移以及预后的mark等等
miRNA用于疾病的分子分型
- 某些特定的miRNA分子和结直肠癌的特定的组织亚型密切相关。例如在粘液性结直肠癌和溃疡性结肠炎诱导的结直肠癌患者中，miR-205和miR-373的表达水平显著增加；但是在缺乏粘液成分的散发性结肠腺癌中，miR-205和miR-373的表达却没有显著的变化
- 体外研究也表明，miR-205和miR-373可以诱导肠道上皮细胞，表现出一定的粘液性恶性增生的特征；因此这一类具有组织亚型特异性表达的miRNA分子未来有望成为疾病分子分型的依据。
- miRNA的研究在慢性淋巴细胞白血病的分型的临床应用当中也有了重大的进展，研究人员通过对217个miRNA活性的分析，把这217个miRNA分成不同的signature。根据这些signature可以将慢性淋巴细胞白血病进一步细分为不同的疾病亚类，而且由于不同亚类的疾病中它们的miRNA分子表达谱不同，从而可以判断慢性淋巴细胞白血病患者的疾病进展情况。
miRNA作为潜在的药物把点
- 有研究提示，miR-205和miR-221可以作为抑制乳腺癌进展和转移的分子靶点，在一项研究中，研究人员挑选了miR-205和miR-221，并且通过人工合成的方式构建了一个可以起到结构稳定作用的人工RNA分子；通过miR-205、miR-221和人工RNA分子，构建了一个基于RNA的三重螺旋结构。
- 在这个三重螺旋结构当中，miR-205和miR-221是发挥下游功能的效应分子，人工合成的RNA分子起到稳定RNA三重螺旋结构的作用。这个RNA的三重螺旋结构被包裹在右旋糖苷醛聚合物的凝胶中，被植入了三阴性乳腺癌小鼠动物模型当中。
- 最后观察到的结果是，肿瘤的体积缩小了90%以上，而且小鼠的存活期也大幅度提升；这个研究结果提示，基于miRNA的肿瘤治疗方法，在未来具有光明的前景。
