使用的文献：Hypoxic lung cancer-secreted exosomal miR-23a increased angiogenesis and vascular permeability by targeting prolyl hydroxylase and tight junction protein ZO-1
- 在之前的内容中，酸菜老师已经介绍了本篇精读文章的大体数据脉络，同时还介绍了研究中的各种要素以及各要素之间的相互关系。在接下来的四节课中，老谭将介绍miRNA相关的背景知识和基础知识，加深大家对于miRNA领域的认识。随后老谭会带领大家详细探讨这篇精读文章的数据内容和研究逻辑。最后我们共同探讨数据作图中需要注意的原则问题。
- 我们首先开始第五节。在本节内容中，老谭将介绍miRNA的发现历程、miRNA的命名规则以及miRNA的生物合成过程等基础内容，帮助大家深入地了解miRNA相关的背景知识。
- miRNA是动物、植物、微生物甚至包括病毒在内的，生物普遍存在的一类单链非编码小RNA分子。它们的序列长度大约是22到25nt，并且在物种间具有一定的保守性。
miRNA的发现历程
- 第一个被确认的miRNA是Lin-4，在1993年由Victor Ambrose实验室在线虫当中发现的。他们利用定位克隆技术发现了Lin-4基因。进一步研究发现，该基因不编码任何蛋白，但是却编码一个长度在大约20个核甘酸的小分子RNA。这个小分子RNA与线虫、抑时发育时序通路基因Lin-14的mRNA的3’-非翻译区特异性结合，进而抑制Lin-14基因的翻译，负调控Lin-14蛋白的表达。
- 2000年，Gray-Rothkamp实验室发现第二个非编码RNA，Lat7。这个小RNA通过与Lin-14基因的3’-UTR之间形成互补结合，从而负调控Lin-14蛋白的表达。同时发现Lat7序列在不同物种间具有一定的物种间的保守性。
- 此后，研究人员意识到，非编码小RNA，也就是miRNA，可能在物种中广泛存在，因此在2001年，Science杂志上同时有三篇文献，报道物种中存在大量非编码RNA，并且将其统称为miRNA或者是mRNA。
- 此后，miRNA的研究迅速吸引了大批科学家的关注，并且成为目前生物学研究热点领域之一。
miRNA的命名规则
- 在命名规则统一前，最先被发现的几个miRNA基因，根据其表型，分别被作者命名为Lin-4，Lat7等等。
- 在2001年，Ravkin，Ambrose等三个实验室同时发现大量的非编码小RNA，因此他们商定将这些小RNA统一命名为miRNA，并且将具体发现的每一个miRNA按照发现顺序进行数字命名。相应的miRNA编码基因用小写字母及斜体表示。
- 高度同源的序列给以相同的命名，并增加一个小写字母代表同源序列间的少数碱基差异，例如miR-2a，miR-2b。
- 如果在基因组不同位点产生相同的miRNA，则在其后面进一步加上短横线以及数字后缀，比如miR-6-1，miR-6-2。
- miRNA的初级转录前体被称之为primary miRNA，发卡结构被称为直接前体，precursor miRNA。对于来自同一条precursor miRNA前体的两个miRNA分子，则用类似miRNA-56以及miRNA56* 来表示，其中带” * “的miRNA表示表达量比较低，属于隐性表达。
- 如果暂时不知道两个miRNA分子的显隐性表达关系，就用类似miR-142-5p以及miR-142-3p的形式，表示两个miRNA分别来自同一发卡前体的靠近5’-或靠近3’-的序列。
- 在表示不同物种来源，但序列相同的miRNA分子时，可以在序列前面加上3-4个字母代表物种的前缀，比如来自人类的miRNA可以标注为hsa，而来自小鼠的miRNA则可以标注mmu。
miRNA的生物合成过程
- 动物的miRNA生成是一个极其复杂的生物学过程。大部分miRNA基因通过RNA-pol Ⅱ转录成原始转录本，也就是primary miRNA。这个原始转录本的典型特点是具有一个双链茎环结构，一个末端环和两侧非特定结构的单链部分。
- 这个primary RNA在Drosha酶的作用下被加工，形成一个包含有大约70个核苷酸的茎环RNA，也就是前体miRNA，precursor miRNA。
- precursor miRNA迅速被转运蛋白X-protein V转运到细胞质当中。X-protein V不仅可以将细胞核内的precursor miRNA转运到细胞质当中，而且对于维持细胞核内precursor miRNA的稳定性也十分重要。
- 在细胞质中，precursor miRNA在Ⅲ型RNA酶Dicer的作用下，被剪切成大约含有22个核苷酸的双链miRNA结构，也就是miRNA和miRNA* 的双链结构。
- 随后，miRNA和miRNA* 的双链结构被解旋，其中一条链被称之为guide strand。它能够和AGO蛋白结合，形成RISC复合体，也就是RNA-induced silencing complex，RNA诱导沉默复合体，这条链被称之为miRNA。
- 另一条链被称之为passenger strand，很快会被降解，用” * “表示，也就是miRNA* 。
- 至于哪一条链能够被装载到AGO蛋白上，主要取决于miRNA、miRNA* 双螺旋结构的内在热动力学不稳定性。其中，5’-末端、相对更不稳定的那条链将被装载到AGO蛋白上，形成成熟的miRNA。所形成的RISC复合体，利用miRNA为模板，通过碱基配对的方式，指导AGO蛋白识别并且剪切靶标mRNA或者抑制其翻译。
RISC复合体
- 在成熟的miRNA发挥功能的过程中，RISC，RNA-induced silencing complex，也就是RNA诱导沉默复合体，发挥了最为核心的功能，介导了成熟miRNA抑制下游靶基因mRNA的翻译，或者直接导致下游把基因mRNA的降解。
- RNA诱导沉默复合体RISC，是由多种不同的生物大分子组装而成，其中最重要的三个组分，分别是成熟的miRNA分子，Dicer酶和AGO蛋白家族成员。
Dicer酶
- Dicer酶的作用是在细胞质中，将precursor miRNA剪切成大约含有22个核苷酸的双链miRNA结构，也就是miRNA和miRNA* 的双链结构。
- Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族成员，在进化上高度保守，序列分析表明，各个物种的Dicer都具有相似的结构域。
- 在这其中，Dicer酶的N端是一个RNA解选酶结构域，随后是一个PAZ结构域。
- 在C末端，是两个RNA3结构域和一个双链RNA结合结构域，也就是Double Stranded RNA Binding Domain DSRBD。
- 位于Dicer C端的RNA3结构域和双链RNA结合结构域，在辅助蛋白的参与下，共同介导Dicer酶催化双链RNA切割为成熟的miRNA，随后参与RISC复合物的装配起始过程。
AGO蛋白家族
- AGO蛋白是一类在进化上保守的蛋白家族，其家族成员能介导成熟miRNA发挥下游基因沉默的功能。
- AGO蛋白家族可以分为AGO蛋白和PiV蛋白两大亚家族，目前发现AGO基因在不同的生物体内数量不同，比如在宿酒劣质酵母中发现了一种，而在秀丽饮干线虫当中有27种。
- AGO家族成员结合miRNA，指导miRNA分子根据序列识别下游靶基因，并且使miRNA下游靶基因发生沉默。
- AGO蛋白和相关的miRNA构成RISC复合物，而且是RISC复合物当中最关键的组分之一。结构生物学的研究发现，AGO蛋白家族成员有两个重要的功能保守结构域，分别是Paz结构域和PiV结构域。
- AGO蛋白当中的Paz结构域是由六条β折叠组成的桶状结构，结合miRNA。PiV结构域能特异性地对靶基因mRNA进行剪切。
- PiV结构域有两个保守的精氨酸残基，而且它和RNA酶H有相似的结构，依赖于镁离子发挥作用。
miRNA的降解
- miRNA与其下游的靶基因mRNA之间，通过复杂的网络调控关系，共同参与介导了细胞的重要生理和病理过程。
- 在miRNA调控的过程中，成熟mRNA分子的降解和成熟mRNA分子的生物合成一样的重要，而且共同调控了细胞的功能。
- 在miRNA的成熟过程中，会产生一个双链的结构，这个双链结构中有一个guide strand，未来会成为成熟的miRNA分子，另一个是passenger strand，也就是miRNA* 。在细胞质中，guide strand会和AGO蛋白相互结合，在和AGO蛋白结合之后，guide strand分子稳定性会大大提高。相反，passenger strand，也就是miRNA* 链，则会被降解。
- 研究发现，AGO蛋白会更加偏向于和有很多下游靶基因的miRNA分子相结合，但是却不会倾向于和没有靶基因的miRNA分子发生相互作用。这也解释了为什么AGO蛋白能够和guide strand结合，而不和passenger strand结合，因为guide strand下游靶基因很多，而passenger strand下游几乎没有靶基因。
- 即便是来源于guide strand成熟的miRNA分子，在发挥完生物学功能之后，也要通过生物降解途径关闭相应的功能。在线虫当中，成熟miRNA分子的降解过程，由5’到3’方向的核糖核酸外切酶Xrn2介导完成。核糖核酸外切酶Xrn2有时也会被称为Rat1P。
- 在植物当中，成熟的miRNA分子降解过程中，是由小RNA降解核酸酶，也就是small RNA degrading nucleus SDN家族成员介导。但是降解的方向和线虫中的方向正好相反，是以一种3’到5’的方向进行。在动物体的基因组中，也编码了类似的酶，但是这些酶在动物体内发挥降解成熟miRNA的机制，并不是特别清楚，还需要进一步的研究。
