使用的文献：Hypoxic lung cancer-secreted exosomal miR-23a increased angiogenesis and vascular permeability by targeting prolyl hydroxylase and tight junction protein ZO-1
- 这节课让我们来提炼总结一下miRNA研究的策略要义，怎么玩转miRNA为主变量的研究，让IF从1-10的课题我们都会设计，可以体会一下课题设计的延展性，要避免在搞研究的时候东敲一下西打一下，成果过于零碎。
- 我们应该学习科研设计的整体思维，从低到高慢慢搭积木会做，从高到低根据情况减配置也能驾驭；有多少预算，就做多少规划。一旦实验遇到了风险，就能及时的调整策略。
miRNA的单变量研究套路
- miRNA最基础的玩法，是把它当成是单变量来研究，直接建立一种miRNA主变量与表型的创新关系。
- 这篇文章是做血管新生的，表型恒量的模型-实验方法-分子标志套路在前面几节课的内容中我们讨论过了，这里再复习一下。
- 用HUVEC细胞做血管形成，内皮细胞迁移，血管渗透性以及穿内皮细胞实验，往里面带入不同的miRNA分子，只要是出现有表型的就能发表
- 有同学会说：“我不知道哪个miRNA有表型”，可行的选择有高通量筛选。又不会猜，又不想花钱，哪里有凭空而来的SCI呢？
- 有了创新主变量之后，按照单变量论证的规范来做实验设计，表达差异-正反回复-细胞动物：miRNA的过表达和沉默其实只要转染化学合成的就可以了，少数转染效率很低的细胞用下病毒载体。但是HUVEC细胞是没有必要的，可以肿瘤细胞做一点迁移运动的表型，然后在血管内皮细胞上面按照血管新生的这一套做一遍，就算文章没有机制，也是一篇工作量还可以的小文章了。
miRNA的机制研究
- miRNA跟表型的联系做完就发表，是非常浪费的科研思路，因为miRNA的机制研究真心比较简单，课题设计好歹可以来个二元变量吧，下游再来个变量，这样就是有分子机制的文章了，IF>3基本也是板上钉钉的事情了。
- 二元变量有两种做法：
- 第一种是间接机制，不要以为miRNA只有抑制靶基因一种机制，我们做miRNA加上通路的间接二元也是可以的，简单高效。过表达或者抑制miRNA主变量之后，我们只需要去检测通路明星分子的变化就OK了，这就是调控关系的论证。下面我们再用通路的激活剂或者是抑制剂，沿着miRNA对通路调控的反向进行操作，那就是Rescue了，调控关系加Rescue二元变量论证套路，撑起一篇IF=3左右的文章的故事。
- 当然miRNA机制研究最经典的，还是直接机制的二元组合；用数据库预测靶基因，然后荧光素酶报告基因实验验证直接机制。注意，调控关系的“你动我也动；我不动，你动也白动”的Rescue验证也需要做。因为miRNA对靶基因一般是负调节关系，Rescue口诀适用的是“反正正”或“反反反”，也就是同时过表达miRNA和靶基因，或者同时沉默观察表型的回复趋势。
- 做完了这两步，再加上结合的验证和位点的验证，都用荧光素酶报告基因实验，只是做位点验证的时候是需要做靶基因3’-UTR的突变载体的。那么整套的机制数据，再加上前面的细胞、动物、组织、标本四个维度的单变量论证数据，冲击IF=5还是有一定指望的
miRNA的三元变量组合
- 前面说了三种由浅入深的研究策略，下面是第四种，是在第三种基础上进行升级，在靶基因的下游再加一个因变量，变成miRNA加靶基因，再加下游明星分子的三元变量组合。
- 靶基因对下游明星分子的调控关系，我们要创新一点的话是可以原创关联的，如果不想那么累也可以去验证一组已知的调控关系。因为多了一个变量，那就多了很多的论证工作了
- 首先是调控关系，“你动我也动”的部分，操作主变量需要观察下游两个分子的变化。
- 其次是Rescue的环节，除了观察表型回复，我们还要看下游因变量表达回复没有，甚至还要设计主变量加下游明星分子回复，来观察表型的Rescue策略。
- 在我们这次讲的文献案例里面，miRNA靶基因PHD的下游跟了HIF-1α，作者就做了主变量和HIF-1α的双操作，看表型是否回复的实验。
- 如果说前面二元直接机制要发到五分我们还要冲一冲，数据需要扎实一点，主变量的创新程度要高一点；那么把逻辑结构升级成三元，五分就基本没有任何压力了，毕竟把三组Rescue策略一做，间接调控就到顶配了。
- 还有一组直接交互作用我们做到Mutation的位点验证，一股豪华感就迎面而来。三元变量组合的文章，把主变量放在最上游并不是逻辑上最舒服的，因为只有效应环节，没有驱动因素的解释。
- 那么第五种策略咱们就把三元组合的位置调整一下，把主变量放在中间，设置上游和下游两组创新的调控关系。下游那肯定是直接机制靶基因，上游呢间接机制也行，直接机制比如说转录因子调控miRNA，哇这就厉害了。到了这种三元，有两组直接机制的设计数据质量又能上一个大的档次，十分以下我觉得基本如鱼得水，能不能过十分要看科学假设的创新程度，但必然也可以冲一冲。
- 讲文献泛读的时候分享过Cancer Research上面这篇三元变量的文献，虽然它是以MDA7作为主变量的，但它的miRNA也有一定的创新价值，包括miRNA调节靶基因也是创新的关系。所以其中的论证格式，大家可以参考一下。上下游都有的三元变量，Rescue论证的核心要放在围绕主变量的部分，做上游和主变量以及主变量和下游的两组双操作。而上游因变量和下游因变量的双操作，这个Rescue可以省略。这个道理我在三十六策 Lesson 15有详细讲解过，大家可以回到猫-老鼠-大米的三元案例去复习一下。
在文章中加入外泌体和其他要素
- 做到三元组合两组直接机制就到头了吗，并没有。我们今天的主题是外泌体加上miRNA，机制的故事还可以设计在二元细胞交互的空间场景里，进一步增加逻辑层次感。
- 我们在这里分两步走，先来一组简配的细胞交互设计，机制研究讲究先下后上，咱们把细胞交互里面的供体细胞的一些细节给省掉，直接从循环外泌体中检测到差异表达的miRNA分子开始做起。这也不难操作，直接取患者的血和正常人对照，送测序就行了。找到了差异分子我们还可以套用血管新生这一套东西，其实做什么表型就套用什么表型的模型-实验方法-分子标志，在效应细胞里面做一套体外体内多维度论证的数据就好了。
- 加上了外泌体，Rescue操作的环节就多了一个。即使是miRNA加靶基因的二元变量，也可以加入外泌体阻断miRNA去观察靶基因变化和表型回复，还可以在效应细胞里面直接去做miRNA和靶基因的Rescue双操作。如果我们在像上面第四条策略一样，靶基因下游再串一个变量，加一个明星分子，故事还能更精彩。
- 最终策略的升级，也就是真正的二元细胞交互，既有受体细胞miRNA加靶基因的二元直接机制，也有供体细胞上游因变量和miRNA主变量的二元机制。我们不管上游因变量是做了间接还是直接机制，至少是三元变量+二元细胞交互的标准格式是娱乐，就已经比第五种策略又明显有升级。两组直接已经可以冲十分了那这第，七种当然目标就是过十分了
总结
- 最后我把七种策略所需要的数据规范格式做了一个对照表
- 低分阶段围绕细胞表型来做，机制选作，动物实验和组织标本都可以省，实验内容短平块
- 到了三五分的档次，机制就一定要把变量数量和直接交互关系给叠加上去，动物实验和组织标本验证作为选作项，来增加数据的质量。
- 到了五分以上冲击十分的档次，那数据省略就不要想了，一定要能做多扎实就做多扎实，而且要套用高阶的逻辑框架。
- 今天这一门套路课就教了外泌体加miRNA的玩法，也许我们的第一篇十分就是在这个框架下运营出来的。要说十分有什么套路最简单的话，相比较那些蛋白蛋白相互作用，蛋白lncRNA相互作用的实验，miRNA外泌体还是要简单多了。我可以毫不夸张的说，这是冲击十分目前最简单的研究策略
- 有发十分的目标和准备，我们发过五分是一个大概率事件，各位学员们还等什么？
