使用的文献：Hypoxic lung cancer-secreted exosomal miR-23a increased angiogenesis and vascular permeability by targeting prolyl hydroxylase and tight junction protein ZO-1
- 套路总是迷人的，读一篇文献胜过读十篇的秘诀，就是把领悟到的数据框架提炼出来，变成科研设计的通用原则。这一节课的内容是演示在整理这篇文献研究思路时，依据数据呈现的逻辑和细节，提纲切领地还原出文献背后潜在规律的过程。
Fig.1 & 2
- 我们再回忆一下数据展开的线路，这篇文章有一些关键词，从读题目的时候就能抓到。首先是Hypoxic缺氧的，缺氧是肿瘤研究中的典型表型，缺氧条件下的血管新生和肿瘤细胞血管侵润，它可以看作是一个多表型的嵌套，逻辑上是有因果关系的。缺氧是分泌外泌体，以及导致外泌体中主变量miR-23a表达上调的驱动因素。这种科学假设有来龙去脉，有上下游的兼顾，起点就站得比较高。
- 既然缺氧是一种表型，那么就一定会有一套跟缺氧相关的模型-实验方法-分子标志的恒量套路，HIF-1α就可以算是其中的分子标志，这篇文章中的Fig.5还把HIF-1α当成了下游变量，做了对HIF-1α的调控关系和rescue。一个明星分子它是表型的分子标志还是变量，关键是看它有没有出场的机会，能不能跟主变量或者是机制的因变量一起，讲述一个调控或者是交互的故事。有机制的戏份它就是变量，否则就简单归为分子标志就可以了。
- 文章题目里第二个关键词是exosomal外泌体的，缺氧和外泌体都是用来修饰主变量miR-23a的。那一看到外泌体，我们脑子里面就应该浮现出外泌体研究的一套数据规范，比如说电镜观察、检测外泌体的表面marker、用荧光标记外泌体，观察它被受体细胞摄入的过程。这些Fig.1&2里面出现的典型数据，就是研究外泌体的数据套餐，我们从中应该提炼格式，由此及彼，触类旁通。
- 继这篇文章题目的主变量之后，表型的关键词有angiogenesis血管新生和vascular permeability血管渗透性。这是一组有相关性的表型，讨论了肿瘤细胞新生血管，并且通过血管屏障发生转移的过程。文章设计了四个表型实验，分别是内皮细胞迁移实验，血管形成实验，血管渗透性实验和肿瘤细胞穿内皮细胞能力的检测。这些实验都有标准化的试剂盒，文章的method部分是有描述的，我们也可以同样提炼学习。
Fig.3 & 4
- 外泌体的套路还没有完，miRNA加上外泌体，我们要检测miRNA的前体，这个我们在Fig.3当中可以学到。miRNA的研究有一套标准数据流程，机制研究是我们是要找靶基因，有负调节关系的论证，和荧光素酶报告基因实验验证相结合的经典实验配置。外泌体、主变量、靶基因再加上表型有四个要素，在实验当中外泌体是确定要加的，然后回复主变量-观察靶基因和回复主变量-观察表型以及回复靶基因-观察表型，这是三个rescue的逻辑节点，属于一套规范性论证的rescue要求。这些必要性逻辑的排列组合，文章都是做到了，体现了数据格式的规范性。
Fig.5 & 6
- miRNA套路的研究数据并没有结束，在Fig.6还有一套模式类似的。我们对比之后会发现一些秘密，血管生成有两个表型实验，Fig.4回复实验只验证了一种，而Fig.6它验证了两种表型，但是Fig.6没有做下游靶基因这个节点的rescue。那这些缺失的数据我想未必就是作者没做，也有可能做了没做出来。
- 科研逻辑有完美论证，但是数据表现是很难完美的，受到了各种客观条件的限制。一定程度的不完美在文章里面随处可见。
- 我们从这篇案例文献可以学习两个表型+两个靶基因的miRNA套路玩法，这样的数据层次显然对文章是有加分作用的，但是工作量上它有加成，研究难度上面并没有大幅的提升，比较讨巧。
- 我们也可以学习miRNA靶基因的下游可以再找一个因变量，也就是做下游的下游，下游的下游虽然是支线论证，但是更多元变量的组合会带给文章有深度的机制故事。更何况从缺氧环境HIF-1ɑ高表达，最后机制又绕回了HIF-1ɑ，这就有了缺氧环境下自我激活的概念，在故事情节的可读性上又有了加分效果。下游的下游是间接机制的多元变量论证，有了miRNA加上靶基因的直接作用，往支线走的时候配间接机制是比较合适的。毕竟不是主线，我们可以稍微简略一点。调控关系加上rescue验证，是间接机制论证的标准动作。回复主变量-观察HIF-1ɑ，回复PHD-观察HIF-1ɑ以及回复HIF-1ɑ-去观察表型，这几步回复节点的操作，逻辑性很强。
Fig.7 & 8
- 文章科学假设的逻辑环节其实在细胞实验就已经做完了，后面Fig.7和8就只是在动物水平和组织水平进行验证，都是增加数据的严谨性。
- 动物实验把机制靶点的rescue都给省略了，只围绕了主角miR-23a进行外泌体加上阻断miRNA的回复验证。在动物实验的策略上，有先处理细胞-再建模型，以及先建模型-在体注射这两种。相当于是预防性给药和治疗性给药。这篇文章也做了两种策略的动物实验，论证的数据套路是中规中矩的。
- Fig.8的组织水平研究其实本质上是细胞模型的实验，是用来源于人的血清外泌体来刺激细胞株，观察和重复前面做过的表型。这是一种用人组织标本的补充论证手段，我们看到了又可以学到一招。包括最后来一张机制图，它都是科研套路的细节功夫。这些模式推而广之就变成了通用的研究框架，能让我们长期受用。
按照数据来源的归属分类
- 外泌体特色的研究数据，包括电镜、标记物检测、荧光标记，以及miRNA前体检测，结果是在Fig.1的b、c、d、e，还有Fig.2的a、b、c、d
- 关于表达差异的检测也是有的，Fig.1a是缺氧的marker检测，Fig.3a是主变量的表达差异，而Fig.8a是主变量在组织水平表达差异的验证。
- 第三部分体外细胞实验的表型研究，结果在Fig.2的b、c、d、e、f、g、h，相应的体内表型结果在Fig.7的a、b、c、d、e、f。
- 因为外泌体是可以提取的，组织样本还可以进行提取后的外泌体的细胞表型验证，那这部分结果是在Fig.8的b、c、d。
- 最后还有重头戏——分子机制的部分，主要是在Fig.4、Fig.5和Fig.6的内容全部都是，尤其是里面那些rescue的设计，逻辑很清楚，论证比较充分。
复习之前套路课的内容
- 在之前的套路课里，我们总结了几门套路课文献数据的展开线路，我们会发现其中有不变的规则。有单变量论证规范，二元变量论证规范和直接作用论证规范，这三者是逻辑上的。还有增加数据严谨性的临床相关性论证规范，以及动物实验论证规范，一共五套数据规范格式。今天我们还要再补充一个外泌体研究规范，这是做到了细胞交互的课题，去把玩外泌体这种流行科学问题的时候，才需要进一步增加的数据规则。
- 功能基因和lncRNA两门套路课都是间接机制研究，论证方法大同小异，但是miRNA的机制研究是有自己特色的。跟转录因子涉及的蛋白-DNA交互作用一样，miRNA集合靶基因同样有一套论证的套路，这个我们在本门套路课的后几章还可以学习。再加上有不同表型各自的一套恒量数据套路，像缺氧、血管渗透性、血管新生都有些模型-实验方法-分子标志。这些套路的综合它就构成了一篇完整的文章，各种变化都在里面了。
根据数据规范尝试设计课题
- 根据这套数据规范一项外泌体加miRNA的研究可以从细胞 分子 动物 组织四个维度来这么设计。
细胞模型
- 首先我们要观察细胞交互的表型现象，第一部分数据是外泌体的鉴定，然后马上把表型的变化确认了。
- 接下来，从外泌体里面去找分子对象，确认分子之后完成阻断分子-抑制外泌体表型的rescue验证，把关键的表型逻辑关系给建立起来。然后再补充miRNA前体检测等等外泌体miRNA组合研究当中应该做的标准动作，这样细胞表型就算完成了。
- 我们以前只知道血管新生要做一下tube formation，学习了这篇文献之后，表型部分的恒量套路也别浪费，上来做一套全的，血管形成、血管渗透性、内皮细胞迁移以及肿瘤细胞穿内皮细胞能力的四个assays。恒量嘛，那我们直接拿来借鉴就行。
分子机制
- 第二部分机制的数据，主要是miRNA加上靶基因的玩法。调控关系论证和直接结合论证，再加上回复实验。回复实验有rescue主变量-看靶基因回复，rescue靶基因-看表型回复。如果我们还有下游有更多的变量要素，那我们就再加上回复环节。有了miRNA加靶基因的这种直接作用，我们及时再往下走，也不要搞太复杂了，有一套跟明星分子的关系，把故事讲完了就行了。还有一点需要注意，因为有外泌体，所以在逻辑上毫无疑问是多了一个环节的，但是这个外泌体的环节不会造成跟变量一样的论证负担，因为外泌体就像药物一样，它总归是加进去的，不存在还要反向操作的问题。那同样都是加外泌体，我们就可以在逻辑上面简化一下，阅读文献想不清楚的时候，我们就把这个头给去掉，先把变量间的关系搞搞清楚，然后再把外泌体这个外部的壳给加上去。
动物模型
- 在动物模型的验证中，主变量的表型是肯定要验证的，对于机制的因变量，那些下游分子也是可以验证的，只是这篇文章没有做这些工作。动物实验它本身比细胞实验复杂，如果充分论证还要作那么多的rescue环节，想想都有点折磨人。这篇文章是发在Oncogene的，显然动物实验的论证还有比较多的展开空间。
组织水平
- 组织水平的研究，一般的临床标本相关性研究我们学习过，结合病理资料和生存资料，可以有三表一图的规范格式。
- 这里检测的是血清样本，我们还可以根据BioMarker套路的格式，与其他金标准的检测方法进行诊断和预后判断的比较，做ROC曲线。这样层次感还能提升很多。
- 相比较而言，这篇文章的作者是做了简单了一点，没有临床相关性的分析，只是用病人的血清外泌体，再重复了一下细胞表型实验。这一步当然我们做外泌体研究都是可以模仿，而且我认为还可以放在前面来完成。细胞实验的外泌体表型做完，我们先做一下组织来源外泌体的表型验证，有明确的表型功能再去做机制，因为分子就在那里，总归是可以最后套一个故事出来的，但是我们表型现象不明显，任何机制都是空谈。
- 组织标本的数据可以算得上是医生做研究的特色和必选项，我们是肯定要在自己的研究当中进行论证的。
图形化的呈现方式
- 我们再用三十六策讲细胞交互的逻辑框架把这个研究故事的通用结构图形化地展示一下。
- 细胞交互的课题一般是二元细胞结构，其中一个是donor供体细胞另外一个是recipient受体细胞。在这项研究里面供体细胞是肺癌细胞，缺氧的肺癌细胞；受体细胞是血管内皮细胞。肿瘤细胞有缺氧表型，这是一套恒量；血管内皮细胞有血管新生的表型，这也是一套恒量；中间细胞交互经由外泌体，关于外泌体的分离、鉴定、示踪、标记物检测，再来一套数据套路，我们也可以把它看成是恒量。
- 我们要做的是，把miRNA借导靶基因影响表型这个二元变量直接机制的结构，装到两种细胞里面。因为导入的是miRNA，miRNA有前体加工成熟的过程，那么通过检测前体，来分辨受体细胞的miRNA增加是内源性的，还是外源性的，这就是一种规范化的做法了。miRNA的靶基因连接的是表型，它是在受体细胞的，受体细胞还可以做下游的下游机制，找别的明星分子。
- 同时，从逻辑框架上我们也可以从供体细胞去做miRNA的上游机制，重新建立更多元的变量调控关系，甚至是组合成转录因子-miRNA的上游直接调控，把套路3和4给组合一下，一篇10分以上的文章可能就出来了。学了今天的课不要再停留在miRNA只有来个靶基因机制这种水平了，miRNA的课题框架，它的可延展性是超强的。
