外泌体-miRNA研究套路 Lesson 11 血管新生实验及数据统计

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使用的文献：Hypoxic lung cancer-secreted exosomal miR-23a increased angiogenesis and vascular permeability by targeting prolyl hydroxylase and tight junction protein ZO-1

• 在接下来的两讲内容中，我们将围绕着内皮细胞相关的实验及技术进行讲解。

肿瘤血管新生背景复习

• 可以参考这节课的内容
  
• 肿瘤血管的生成是极其复杂的过程，一般包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环、形成新的基底膜等等步骤。由于肿瘤组织新生血管结构及功能的异常，且血管基质的不完善，微血管容易发生渗漏，因此肿瘤细胞不需要经过复杂的侵袭过程就能直接穿透血管，进入到血流并向远处的部位形成转移。
• 越来越多的研究表明，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢，而大多数的恶性肿瘤血管生成密集且生长迅速，因此血管生成在肿瘤发生转移过程中起着非常重要的作用，抑制这一过程就能够明显地抑制肿瘤组织的发展和扩散。
• 体外的血管生成实验能够很好的模拟肿瘤血管发生过程，探讨血管发生的机制，是发现促进或抑制血管生成药物的重要研究工具。

血管生成实验的材料和基本的步骤

• 材料主要是内皮细胞和基质胶，步骤我们在这里把它分为三个部分：

制备基质胶

• 首先是制胶，关于基质胶的注意事项会在下一张ppt中进行比较详细的介绍。
• 我们在这里首先要将分装好的基质胶化冻，采用的是4°C冰浴过夜的方式，化好的基质胶呈液体状，再使用提前预冷好的枪头将液体状的基质胶铺在孔板中，一般是96孔板孔每个孔铺50微升的基质胶。
• 基质胶可以按照1比1的比例稀释，也可以直接使用原液，需要大家的预实验看胶的凝固效果。
• 最后我们将孔板放入到37度的孵箱内，孵育30到60分钟，等待胶凝固后，这样我们的第一步就完成了。

接种细胞

• 接种细胞，一般是2万到3万个细胞，这也是需要我们设置细胞梯度摸索浓度的。
• 成管的时间与细胞浓度相关，一般2到6h就会有成管现象，整个观察时间一般不会超过24h，24h后形成的血管环有可能出现崩解。

图像的采集处理和分析

• 倒置显微镜下采集图像，使用ImageJ或者IPP分析图像
• 主要的记录指标有成管长度，成环数量，交叉点数，以及细胞覆盖面积。

实验的注意事项

Matrigel基质胶

• 基质胶最早是BD的产品，这两年被康宁收购了。基质胶是BD采用专利技术，从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中分离出来的。主要的成分由层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、潮蛋白、硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含了生长因子和基质金属蛋白酶等等。
• 每个批次的基质胶的浓度都不同，当我们的实验要根据基质胶的浓度进行配置时，我们要根据批次号查询一下该批次基质胶的浓度。
• 商品化的基质胶有不同的配方，除了最基本的配方以外，也有经过不同处理的，类似于有低生长因子的、有去除酚红的、也有的专门高浓度的基质胶。
• 在成管实验中，如果我们后续还要对细胞进行荧光染色、观察成管情况的话，建议选择去除酚红的、可以有效的减低背景。当我们要看药物处理对成管现象的影响的时候，也要选择低生长因子的基质胶。
• 另外，基质胶在室温或37°C时会很快凝固，因此，我们在分装基质胶时，一定要注意把枪头、分装管预冷，而且也要在冰上进行分装。分装后，尽快放入-20°C或-80°C的冰箱里。
• 做成管实验铺胶时，要使用无血清的基础培养剂对基质胶进行稀释，最多的稀释比例不能超过2倍，稀释太多会不成管，影响实验。
• 铺胶的手法需要训练，胶面不平，混入气泡，都会影响我们的拍照效果。在这里分享一下，我们可以选择24孔板进行铺胶，效果稍微会好一些。
• 做成管实验时，选用的耗材一般会选择比较一般的细胞培养板，如果实验室经费预算充足的话，推荐使用德国的ibidi，采用这个方法可以减少基质胶的用量，也可以防止使用孔板铺胶时不可避免的凹液面。

内皮细胞

• 在做血管生成实验时，我们第二个要注意的是内皮细胞。
• 我们选择的内皮细胞可以是自己分的奇静脉内皮细胞，也可以是买的商品化内皮细胞。细胞要选择7代以内的，最好是使用3-5代的细胞最为合适。
• 一般培养内皮细胞时，我们会用专用的内皮细胞培养基，或者是自己添加细胞因子配置的。在这里我分享一种内皮细胞的培养方式，小伙伴们可以参考一下。基础培养基选择的是M199，加入10%的FBS，再加入1纳克每毫升的内皮细胞生长添加物，再加入10个单位每毫升的肝素，还有1.25微克每毫升的胸苷。采用这个方法培养内皮细胞成本比较低，而且内皮细胞的状态维持的也比较好。
• 我们在做试验的时候要注意降低培养液中的营养成分，这样将有助于我们成管。
• 再有就是前面也提到过的细胞数量，一般会选择2万到3万个细胞为宜，需要我们进行预实验来摸索条件。
• 在做成管实验的时候，可以添加VEGF等细胞因子，将有助于我们的细胞成管。

拍照时间

• 拍照的时间点要把握好，一般在2到6h就会有成管，12h基本已经可以形成明显的管状结构，24h以后管状结构就会崩解，所以一般拍照时间不会超过24h，大部分是在12到18h以内即可完成。
• 因此我们在拍照设计时间点时一定要注意相对密集些，记录下照片。

成管后的染色

• 常用的染料有两种，一种是钙黄氯素，是亲脂性染料，可以透过细胞膜发出绿色的荧光。另外一种是DL，是一种亲脂性膜染料，进入到细胞膜后会激发出很强的红色荧光。

血管生成抑制剂，

常用的药物是苏拉明，可以抑制细胞成管。

图像的采集、处理和数据分析

• 采集的图像可以是黑白的相差图，也可以是荧光图像。如果是荧光图像，我们要将图像转化成灰度图进行分析。
• 我们要分析的指标有：成管的长度、成环的数量、交叉点数和细胞覆盖面积。

网上的付费方式

• Wimasis图像分析在线平台，是一个付费的细胞实验图像分析平台，我们只需要将细胞实验后获取的大量图像，通过简单的上传就能获得图像分析的结果。
• 这个方式的优点是，简化了繁琐的图像分析流程，而且能够得到标准化且可靠的实验图像分析数据。我们可以根据自己要分析图像的数量，选择不同的打包价格，当然，这个价格也非常不菲。

ImageJ进行图像分析

• 我们再来介绍一下比较经济的方法，采用ImageJ进行图像分析。推荐ImageJ，相对Ipp更简单一些。
• 第一步，我们先要打开分析的图片。
• 第二步，打开血管生成的分析软件。
• 第三步，我们再选择菜单栏里网格状这个选项，跳出的下拉菜单后选择奇静脉相差图像分析，等待两分钟，就会自动跳出分析好的图像和分析结果。
• 第四步，我们再将结果保存即可

图像分析结果解读

• 最后，让我们再来看图像分析的结果。我们先来弄懂这些参数的意思。
• 结合图片看，图标1是节点，也就是小叉的位置。
• 图标2是交叉点，在图中是这个红色的点，顾名思义是形成的管状交叉的点。这是我们作为统计的重要的观察指标之一，反映的是血管新生的能力。
• 图标3是主干长度，也有人会把主干长度作为成管的长度。
• 图标4是分支长度，图标5是游离分支的长度。我们要统计的成管长度一般是主干长度加上分支长度的。
• 图标6，我们圈起来的地方表示网眼，也就是成环的数量和面积。
• 在实际过程中，由于实验设计，可能很难形成像图片中比较好的血管环。这里也是介绍了相对比较基本的统计数据。我们在实际操作中要具体问题，具体分析。
• 最后，我们采用软件分析，分析的结果是像素。如果我们需要得到微米长度单位的话，是需要进行标尺校正的。