外泌体-miRNA研究套路 Lesson 10 外泌体的鉴定方法

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使用的文献：Hypoxic lung cancer-secreted exosomal miR-23a increased angiogenesis and vascular permeability by targeting prolyl hydroxylase and tight junction protein ZO-1

• 我们在上一节的内容里面一起学习了外泌体的分离方法，在这一节里面，让我们再共同学习一下，如何证明分离出来的就是外泌体。

评价外泌体的标准

• 在介绍方法之前，我们先来看一下评价外泌体的标准。这是2014年由国际细胞外囊泡协会发布的指导性声明文件。
  
• 国际胞外囊泡协会是胞外囊泡研究领域最权威的学会之一，2012年在瑞典成立，随后将总部搬到了美国。JVE是这个协会主办的杂志，主要发表各种胞外囊泡研究的方法和方向。
• 2014年由协会主席Hayle牵头，众多外泌体领域大牛共同署名发表的有关胞外囊泡的指导性声明文件。该声明文件指出了目前研究和定义细胞外囊泡及其功能研究所需的最少实验要求。
• 在这里，还要再说明一下细胞外囊泡。细胞外囊泡是从细胞膜上脱落，或者由细胞分泌的，双层膜结构囊泡状小体的统称，直径从40纳米到1000纳米不等，主要由微囊泡和外泌体组成。
  

胞外囊泡的整体鉴定

从胞外囊泡的特异性蛋白标志的角度进行鉴定

• 最常用的：WesternBlot的方法
• 流式或者蛋白质谱的方式
• 要求的指标：
  • 至少有三个胞外囊泡阳性的标志
  • 一个非囊泡的阴性蛋白标志

对单个的胞外囊泡的鉴定

• 分为两个方面：
  • 透射电镜或原子力显微镜的方式，观测胞外囊泡的大小和膜结构
  • 纳米颗粒度分析仪，也就是我们常说的NTA或者DLS的方式，分析胞外囊泡的颗粒大小和大小的分布情况

胞外囊泡的标志性蛋白

• 这份声明中，标志性蛋白被分为了四个大类
• 跨膜或脂质结合蛋白和胞质蛋白：这两类胞外囊泡的标志性蛋白是与胞外囊泡的产生、组成、运输以及功能等等相关的，这些是与胞外囊泡相关，而与胞外囊泡来源的细胞关联不是那么紧密了。
• 在这里需要解释的是，在实际的操作中并不是所有的这些蛋白在所分离的胞外囊泡或者外泌体中全部表达，除了可能受到来源细胞的一些影响外，在很大程度上还与分离方式息息相关。
• 胞内蛋白，也就是我们在上一张幻灯片里说的非囊泡表达的阴性蛋白标志。一般在这里会选择细胞器相关的蛋白，类似于线粒体相关的CytC等等，以证明分离的确实是外泌体而非细胞器等其他杂质。
• 和细胞来源相关的：这些通常是来源细胞的一些特征性蛋白，类似于网织红细胞的乙酰胆碱脂酶。
  
• 在这张幻灯片中，我们选择了一篇综述，它列举了外泌体标记物在不同疾病中的表达。
• 在不同的生物体液中，在不同的疾病中，分离的外泌体表达有不同的标志，而正是这些特殊的标志，使得外泌体可以作为疾病诊断的标志物。以外泌体的CD81为例，它被证明在慢性丙型肝炎的病人的血清中显著增加，因此CD81可以用于丙型肝炎病毒感染的诊断性标志。同样，在急性肾损伤的患者的尿液中分离的外泌体，发现胎球蛋白A和转录激活标志物3显著增加，因此这两种标志物可用于急性肾损伤的诊断。

检测蛋白的方法

• 介绍完了这些标志性蛋白，我们再来说一下检测这些蛋白的方法。目前常用的是WesternBlot和流式细胞术的方法，当然这两种方式是对已知的蛋白进行检测，根据酸菜老师的名言

  要么筛，要么猜。

• 如果我们想筛选到一些新的标志的话，那就要采用基于质谱的蛋白质组学研究了。我们这里还是介绍一下文章中常用且通用的方式，WesternBlot的方法和流式。
  
• 首先，左图是WesternBlot的图，这幅图是摘自上一讲分离方法的后续的检测，作者筛选了了四块膜蛋白，基本上外泌体都有表达的CD63，多囊泡胞内体产生相关蛋白，Alix和TSG101，以及分子伴侣HSP70和90α。他还选择了阴性蛋白的标志，也就是非囊泡表达的，细胞器相关的特异性蛋白，类似于像高尔基体上的GM130，过氧化物酶体的PMP70，内质网钙结核蛋白Calreticulin，以及细胞核相关的Prohibitin。
• 通过WesternBlot检测，我们可以发现，不同的分离方式下，这些外泌体的标志表达不尽相同的，也再次说明了分离方法对外泌体会造成很大的影响的。
• 再有，对于采用流式细胞树的方式进行检测，一般的流式仪器，分辨率最小是500纳米，低于500纳米，仪器已经无法把我们想要的信号与噪声信号分开来，因此也就无法检测到外泌体，所以就要采用磁珠捕获的方式，用大的磁珠去捕获外泌体进行检测。
• 中间这个表格就列出了细胞，胞外囊泡，以及检测磁珠的大小，我们可以看到有商品化的10微米和4微米的两种磁珠。采用标有特异性抗体的磁珠去捕获表达抗原的外泌体，或者胞外囊泡，再采用标有荧光素的抗体去进行检测。
• 再有一种就是贝克曼公司的技术，他们开发了一款Cytoflex流式细胞仪，采用了紫光侧向角相关的技术，这种紫光侧向角可以将200纳米的颗粒与信号噪声分开来，我们看到下面的这幅图就是使用贝克曼的beads，在紫光侧向角下可以清楚地分辨出900，500，300，100不同大小的颗粒。

单个胞外囊泡的鉴定

• 对于单个胞外囊泡的鉴定，要求的是使用两种不同的方法进行互补。

电镜在内的各种显微镜

• 第一种是电镜，我们用电镜除了要看外泌体的大小以外，还要在电镜下注意观察外泌体的典型的形态，看我们观察到的小颗粒是否就是外泌体。外泌体的典型形态是在磷酸钨复染下，可以显示出双层膜的结构，且呈茶托形或一侧凹陷的半球形。
• 我们在观察电镜时一定要注意这个双层膜的结构，因为许多病毒颗粒的大小都与外泌体类似，但是形态不同。尤其我们在使用PEG沉淀时，背景会不干净，许多大家误以为是外泌体的，可能只是PEG或者是一些蛋白颗粒。
• 还有一种技术是免疫胶体电镜，就是把免疫学方法与电镜结合，形成的一种免疫电镜检查术。
• 最近很火的原子力显微镜。原子力显微镜最大的优点是不需要处理，可以直接显示外泌体的三维结构，但是它的成像范围比较小，而且成像的速度也比较慢。

对颗粒大小和大小分布的检测

• 采用的检测方式主要是通过纳米颗粒跟踪分析技术，也就是我们常说的NTA，或者动态光散射技术，也就是DLS。这两个方法类似，都是利用光散射和布朗运动的特性，获得悬浮在液体中样本的粒度和分布等等多个特征。
  
• 左图采用的是NTA方法，进行检测外泌体大小和分布的图，纵坐标是表示颗粒的浓度，横坐标表示的是颗粒的大小。图中的黑色实线是颗粒大小及分布情况的平均值，红色的线是这个平均值加减标准差的范围情况。
• 我们在看结果报告时，主要关注的是颗粒大小的平均值，反映的是我们观测样本的颗粒的平均大小情况，还有观测样本颗粒大小的众数，所谓的众数就是出现次数最多的数，同样反映的也是观测样本的集中趋势，最后就是观测样本的浓度。
• 我们再看右边的这四幅图，来源还是上一讲中不同分离方式分离外泌体后的粒径大小的检测，采用的也是NTA的方式，不过在粒径大小上区别不大，但是在浓度上还是有显著性差异的。

对外泌体进行功能研究时应该特殊注意到的一些问题

• 在这篇声明中，除了对外泌体的鉴定特征进行规范化要求外，还指出了在外泌体进行功能研究时应该特殊注意到的一些问题。我们从不同的几篇文献里找到了一些图利，方便给各位小伙伴作为演示。

剂量依赖性

• 当我们给予不同剂量的外泌体时，我们应该观察剂量依赖性的作用（把剂量依赖性作为研究要观察的指标之一）。

合理的对照

• 在做外泌体功能研究时，对照的设置非常重要。
• 声明中的原话是，我们所设置的对照是显示最小的功能影响。
• 这句话可能不太好理解，在这里选了一幅图，方便小伙伴们体会。这篇文献中，作者想要证明CD34细胞来源的外泌体具有修复下肢屈曲的功能。除了设置PBS的对照外，作者还另外设置了CD34阳性细胞，CD34阳性细胞培养液，去除外泌体的CD34阳性细胞培养液，以及去除CD34细胞的单个核细胞。
• 这些对照组对结果的说明，以及对下游实验靶点的筛选都非常重要。

胞外囊泡相关的蛋白核酸等一系列小分子的研究中值得注意，并且非常常用的方法

采用RNA酶处理

• 采用RNA酶处理外泌体以后，我们能够证明是外泌体内的物质发挥作用，而并非粘附于外泌体上的一些物质发挥的作用。

标记外泌体

• 我们对外泌体进行荧光标记以后，就能够看到外泌体被细胞吞噬并且发挥作用的

采用JW4869等等抑制外泌体释放的药物

• 用这种药物处理细胞以后，我们能够证明细胞是通过释放外泌体运输活性物质的。