使用的文献：Hypoxic lung cancer-secreted exosomal miR-23a increased angiogenesis and vascular permeability by targeting prolyl hydroxylase and tight junction protein ZO-1
- 酸菜老师的观点：miRNA是所有分子类型里面新手入门最佳的选择，号称新手之友，文章的影响因子从1到10，这种分子都有可以参考的研究体系。
- 这次的案例文章来源于2017年的一篇Oncogene，经过了前面两次的套路课学习，我想大家应该能够对这种多元变量，也就是主变量加上通路靶分子作为机制的文章结构应该很熟悉了。这次的文章难度提升了一些，它是外泌体加上miRNA的套路，这是一种让很多人心头痒痒却又不敢下场做的文章类型。文章关注缺氧环境下，肺癌细胞外泌体里miR-23a介导肿瘤血管新生表型。
Introduction Part 1
- 我们先把文章题目读一下，因为题目里面往往包含着关键的科学假设要素信息，读完题目往往就可以反推出文章的主变量、因变量、表型、疾病这些。首先是主变量miR-23a是施加一个定语 ，缺氧肺癌细胞分泌的外泌体中的miR-23a，那miR-23a就是主变量了。后面increased动词，再接的是表型angiogenesis and vascular permeability血管渗透性和血管新生，然后by一个介词通过什么分子机制的靶点就来了。后面的脯氨酰基氧化酶prolyl hydroxylase，还有紧密连接蛋白ZO1 tight junction protein ZO1
- 第一眼看到这个题目很长，复杂的专业词汇很多，大家不要发怵，一个有效的方法叫做“剪枝”，也就是减去枝叶，这个题目关键信息一眼抓到主变量是miR-23a，调节的表型是血管新生和血管渗透性，然后通过两个靶分子。有这些关键信息就够了，把修饰的那个英语先剪掉来领会关键信息思路就很清楚
- 在Hallmarks of Cancer这篇review中，提到了肿瘤有十大表型，Angiogenesis血管新生就是其中之一。其实跟血管有关的肿瘤表型有两个，分别是转移和血管新生。
- 转移是一个复杂的过程，肿瘤细胞首先要从原位脱落下来，获得运动能力，上皮间质转化EMT的过程可以让肿瘤细胞的运动性增强，然后肿瘤细胞要进入到血管，那就有一个内渗的过程，涉及到血管的渗透性；之后，肿瘤细胞在血管内形成了循环肿瘤细胞CTC，这样穿进血管-穿出血管的过程也涉及到一系列的生物学效应，其实这就是肿瘤细胞和血管内皮细胞的交互作用。
- 血管新生也是这样的一种交互作用，因为肿瘤细胞的生长非常迅速，需要大量的营养和血供，事实上肿瘤内部是处于一个缺氧的状态，而这种缺氧状态可以诱导肿瘤细胞分泌促血管生成因子，这样就能形成肿瘤内部的新生血管。
- 肿瘤为自己创造营养供给有两种形式
- 一种是肿瘤细胞分泌促血管生成因子去促进血管生长，这就是angiogenesis血管新生。
- 另外一种现在也有一定的研究热度，叫血管生成拟态Mimicry，肿瘤细胞来不及招募血管内皮细胞新生血管的时候，肿瘤细胞干脆就自己模拟血管，在内部形成了管腔，这样两头接上血管，供给就跟上了。
- 血管生成拟态这个表型本篇文章没有涉及到大家作为一个知识点了解就好了。
Introduction Part 2
- 文章标题的第一个单词是hypoxic缺氧，缺氧是诱导血管新生的一种条件，缺氧里面最明星的一个分子HIF-1α，中文是缺氧诱导因子-1α，咱们研究肿瘤的肯定都听过。
- 肿瘤研究中之所以经常可以发现表型的交互作用crosstalk，就是因为肿瘤本身就是一个复杂交互的过程。肿瘤发生缺氧，然后诱导血管新生，血管长过来之后，肿瘤细胞还要进入到血管，发生转移的过程。上述复杂的过程涉及到血管的渗透性，这样整个表型之间是相互联系和环环相扣的，所以我们经常放在一起研究，是一个整体的问题。
- 如果抑制了血管新生的过程，断了肿瘤细胞的营养，那是不是不仅仅可以抑制肿瘤的生长，还可以抑制肿瘤的转移？答案是肯定的。这篇文章这篇范文它是把缺氧、血管新生、血管渗透性这几个表型放在一起进行研究，看成一个整体的问题，其实本质上这就是研究的某种“套路”，在设计这类课题时，大家都是这么干的。
- 在阅读一篇文章的时候，我建议大家去领会课题设计的通用性，这样才能够举一反三，灵活应用。这里我们列出了一些常见的临床上治疗进行抗血管治疗的靶点，像大名鼎鼎的VEGF，还有VEGF受体VEGFR，另外还有一个受体是PDGFR血小板衍生生长因子受体。还有两种抑制血管生成的天然蛋白质，有内皮抑素Endostatin，还有血管生成抑素Angiostatin。这些药都弄出来了，可见基础研究还是有价值的，没有靶点的发现，哪来医学转化研究呢。
- 除了缺氧，血管新生和血管渗透性，题目里面还有一个关键词——外泌体Exosome。常规研究都是对一种细胞类型展开工作，就算一个肿瘤中使用了多株细胞系，本质上也是平行同一类型的细胞。但是外泌体课题就涉及到两种细胞的交互作用。
- 请看上面的模式图，当一项研究涉及到两种细胞交互的时候，有一个关键点必须抓住，那就是搞清楚主变量分子从哪里来到和哪里去。哪个细胞是释放信号的，以及哪个细胞是接受信号的，这是逻辑的关键。阅读题目，我们就可以知道，是肺癌细胞分泌的外泌体带着miR-23a到血管内皮细胞去发挥作用。
- 这类研究就比我们之前了解的一个变量，再加上模型-实验方法-分子标志恒量的工作量要大。外泌体miRNA它入到受体细胞之后，围绕血管内皮细胞会有一套作用机制；肿瘤细胞为什么会分泌带有miR-23a的外泌体，这里面也有一套分子机制那么。细胞交互的课题它就相当于把本来针对两种细胞类型的两个科学问题揉在一起，组成一个完整的story，那文章逻辑就复杂了，档次自然就高上去了。
- 我们分析文章思路的时候要学会化繁为简。针对外泌体的文章，我们要一个细胞一个细胞的来探讨机制，这样思路就不会乱了。
读题猜要素
- 套路就是普遍适用的规律，我们在之前的套路课的Lesson 1中练习过8个level的文献宏观理解，让我们再复习一遍怎么读文献，去抓取关键的宏观信息。
- Level 1读题猜要素比较简单，疾病和表型两个关键信息一眼就能抓到。
- 看到了表型的关键词，也就是血管新生和血管渗透性，要有对应的反应，这篇文章肯定有一套做血管新生和渗透性的实验套路。而且常规来说，IF=7的文章，一定是细胞、动物、组织标本这些维度数据都会做到，这就是所谓的模型-实验方法-分子标志恒量
- 这篇文章还有一个关键词，exosomal外泌体的，显而易见我们还可以学到外泌体的一些套路。
- 主变量是miRNA，还有因变量miRNA的靶基因，那毫无疑问咱们还可以学到miRNA怎么做机制的套路。
- 读题猜要素说的是看到题目的关键词，我们对它的套路标签就应该已经定义好了，这样读一篇文章才能收获很多。
看图对恒量
- Level 2是看图对恒量，主要关注的是文章的methods部份。
- 这篇文章里用到的细胞和实验还都不少，不过都是比较常规的，包含了外泌体、血管新生表型、血管渗透性，还有miRNA靶基因验证等等一系列的实验。在后面的课程中，其他老师还会详细的讲到，就不再这里展开了。
分组辨套路
- Level 3是分组辨套路，分组信息非常之重要，看图的关键不是看趋势，追着” * “去看，重要的是关注分组策略，分组策略往往就能代表作者想说明的问题。
- 让我们看看单变量的正反回复策略
- 这篇文章Gain of Function是有的，在Fig.2c做了缺氧外泌体对血管内皮细胞血管新生功能的影响；因为是外泌体套路，它里面还有一个对主变量的验证，在Fig.4b，既做了miR-23a的mimics，也就是过表达；同时也有一个缺氧外泌体的结果对照，属于两种过表达的策略，达到的目的是一样，都是Gain of Function
- 想要寻找有没有Loss of Function，我们就要关注Inhibitor，结果就发现了Rescue的组，在Fig.4d中有加了外泌体，同时还把里面的miR-23a给抑制了的策略，出现了双操作，那我们就要想想是不是Rescue的策略了。我们看方向对不对，外泌体里面是带了主变量的，主变量我再给它抑制掉，这就是妥妥的Rescue了。
- 我们在外泌体的文章里面，一般不需要去单独的去做Loss of Function，因为有了主变量的Rescue策略，这就是很强的证据了，就更有说服力的证明了主变量有功能这一件事情。
读题识变量
- Level 4是读题识变量。
- 这篇文章有两个变量，因为有两个表型——血管新生和血管渗透性，作者分别用了两个miR-23a的靶基因来说明相应的机制，也就是做了两套机制。在这里传递出的思想是，要想发好一点的文章，就得不怕麻烦。如果没有外泌体这个要素，这篇文章其实就是一个标准的二元变量套路，靶分子+因变量的直接作用机制。但是加上了外泌体，提出了miR-23a是从肺癌细胞的外泌体当中分泌过来，这就相当于给了一个上游的驱动因素。
- 这里我们可能会感觉外泌体套路就自带一种“上游属性”，所以这篇文章看上去的结构就相当于是一个三元变量组合，这就比单纯去做miR-23a加上靶基因机制的文章要更加高端。
看图解机制
- Level 5是看图解机制。
- 看到题目中有miR-23a，我们知道miR的研究套路中有找对应的靶基因。我们在三十六策 Lesson 11里面提到过，找miRNA靶基因的关键是靶基因的荧光素酶报告基因验证结果。验证出来的第一个靶基因是PHD1/2，在Fig.4a，另外一个靶基因是ZO1，是用来解释血管渗透性的，在Fig.6a。
结果推结论
- 第六个Level结果推结论
- 我们要把Figure Legend和Result部分的小标题对照着读，这俩想要传递的意思其实是一样的，文章往往就是这样一个结构，很对称很工整。
- 首先是肺癌细胞当中分离鉴定外泌体，结果在Fig1当中。
- 第二段缺氧肺癌细胞外泌体具有促进血管新生和血管渗透性的表型，对照的结果是Figure 2。
- 接下来问题再深入一点，看到主变量miR-23a从肺癌细胞外泌体来，到血管内皮细胞去。如果没有外泌体这个“盔甲”，我们做表型一张Figure就够了。有了外泌体，我们论证步骤就变复杂了，这有两个Figure，分两步来做。
- Fig.4就开始做分子机制了，PHD1/2是第一个靶基因，
- 再往下看，Fig.5怎么出现了HIF-1α，酸菜老师在看到这个结果的时候呆住了，HIF-1ɑ这个分子没在文献中出现，先把它放一放的，继续往下看
- Fig.6发现作者做了miR-23a的另外一个靶基因，做到了血管渗透性的表型，做到了紧密连接蛋白ZO1，就把整个机制基本对上了。
- 这里再回过头去看results部分，去解释为什么要做HIF-1α，原来PHD1/2下游已知能够调控HIF-1α，到这里思路就清晰多了，这就算是一个支线剧情。
- 我们在Fig.7看到了in vivo，好的，这是在体实验，也就是动物。
- 然后Fig.8有patients临床验证，都是套路，跟前面我们介绍过的功能基因套路和LncRNA套路都如出一辙。
检索探背景
- Level 7是检索探背景
- 在上一次的LncRNA套路课中，分子是全新的，没啥背景好挖的。这次，酸菜老师把miR-23a和cancer两个词去组合检索一下子，一口气来了186篇。这结果也太多了，不用看了，就是说明在肿瘤当中去研究miR-23a是没什么新颖性的。
- 接下来就要开动智慧了，我们要尝试不同的检索组合。我们再试试主变量和表型的组合，就是miR-23a再加上angiogenesis。检索出来有11条结果，11条不算多，我们就可以快速的全部扫一眼题目。当我们掌握了泛读文献技巧之后，从题目能够抓到关键信息，进而反推它的科学假设，其实我们一看题目就知道对我们有没有用了。
- 这样一看，其实miR-23a影响血管生成也是之前有文章报道过的，只是人家做的不是外泌体当中的miR-23a。而主变量加上表型其实算不上这篇文章作者的原创。
- 接下来我们再检索一下主变量加上外泌体exosome或者是形容词性exosomal，结果大同小异，也是十来篇文章。我们发现外泌体里面有miR-23a这件事情不是第一次发现了。
- 在这个检索的结果里面我们扫一眼，有一篇文章酸菜老师是比较感兴趣的，是这篇2016年发表在ONCOIMMUNOLOGY上面的。
- 它的影响因子跟OncoGene差不多，缺氧诱导的微泡（另一种囊泡，体积大一点）调节NK细胞，通过携带TGF-β和miR-23a。我们看，这篇新介绍的文章建立了缺氧囊泡和miR-23a主变量之间的关系，只是表型关注的不同。案例文献做的是血管生成的表型，受体细胞是血管内皮细胞，这一篇是研究免疫调节。受体细胞是NK细胞。其实仔细想想，逻辑思路是不是大同小异。
- 检索探背景还没完，接下来我们应该把靶分子、cancer、表型angiogenesis、再加上外泌体exosome，这几个关键词联合起来检索看看，这就只有两个结果了。还有一篇是17年11月份在线发表的，发表在JCP杂志上，IF=4，实际见刊是2018年，隔壁印度人发的，也是跟我们一样特别喜欢套路的一群人。
- 上面的这4个词组合起来，注意我们其实没有加缺氧，但是我们检索到两篇都是缺氧的文章，那酸菜老师就很好奇了，到底缺氧hypoxia或者是形容词性的hypoxic和主变量miR-23a的关系有没有报道呢？我们去检索一下，发现其实结果也有11条。
- 分析到这里，我们就会发现，从idea来说，疾病、表型、分子、加上外泌体、再加上缺氧这个条件，这些要素的组合人家都做过了，我们已经可以说，这文章思路的创新性真的也就那样。
- 最后我们再确认一下，范文里面有两个靶基因，那它俩跟miR-23a有没有相关性的报道呢？我们把这两个词去联合检索一下，发现两个靶基因都只能找到一个结果，就是咱们讲的Oncogene的这一篇。所以文章机制上的创新是无可质疑的有，但到了这个份上其实也已经退无可退的。机制再不行还怎么发呀，这篇文章的科学问题本质上不是原创，这就是酸菜老师评价这篇文章一个综合的学术地位。
- 用不同的关键词去检索，这种策略大家学习了之后，我们总结一下。实际上，酸菜老师感兴趣的，真正看的，只有两篇文章。在实际过程中也就10分钟吧。大家以后在读文献的时候，如果我们正在阅读的某一篇文献套路要深入研究，我们也可以照这个样子，通过题目里面的关键词去组合，去进行不同策略的检，索不同组合会有不同的结果，里面我们再去找感兴趣的点挖掘。这对于自己研究文章套路是很有启发的方法。
溯源揭创新
- 要想真正破解文章思路的来源，我们只锁定主变量miR-23a来检索是不够的。我们要知道，所谓文章套路，就是研究设计、科学问题、场景等都一样，只是变量分子不一样。
- 我们可以尝试思考一下，会不会之前就有人已经研究过1.缺氧条件下的肿瘤细胞能够分泌外泌体2.这个外泌体可以介导血管新生能力。在使用了1+2的套路的各个文章之间，只是分子不一样有，上述的情况有没有可能存在。
- 要去检索这一类的信息，我们可以把miR-23a换成miRNA，把分子调得更泛一点就能检索了。我们能找到好多这种模式的文章，只是换了不同的miRNA。我们也可以把主变量去掉，直接把这些表型、外泌体这些要素组合起来去检索，就怕文章太多我们看不过来。
- 一个更简单的方法是这样的：当我们检索pubmed里面点开Oncogene这篇文章的页面的时候，在页面的右侧有一个窗口小窗口叫similar articles，可以发现一篇2013年的JBC和一篇2014年的BLOOD，看上去题目就很像，咱们点开第一篇去看一看。
- 看题目思路就很像，Exosomal miR-135b从缺氧的多发性骨髓瘤产生，enhances Angiogenesis by Targeting 一个基因，这个结构跟我们讲的这篇文献也很像。我们可以看到在所有的数据里面，有做了三株多发性骨髓瘤细胞分泌的外泌体的miRNA筛选，其中有一株细胞的筛选结果，在左边的table3里面，恰好就有miR-23a。
- 好巧是吧，我们再看看文章的数据套路，比如做miRNA靶基因时候的分组，有常氧也有缺氧，有野生型也有突变型载体。左右两个是不是策略很像，这篇blood是发表于2014年的，我们这篇oncogen是2017年发表的，作者有可能不读这篇blood的文章吗？都要读烂了吧，肯定满满都是笔记，每个数据每个实验设计都仔细的去研究过，那最后大家分子不一样，文章就不一样。这一步溯源揭创新，刚才idea的创新在检索背景的时候，我们通过不同的检索词组合就已经知道了这篇文章大概什么样的创新水平，但是套路的创新这个源头在哪里？源头就在这里。
- 学习套路是让我们在确定的疾病和表型体系下去代入一个新的变量，人家做A我们去做B，我们去筛一筛和猜一猜，这样就形成新的文章了。在机制的环节，我们要做新的、不同的机制，从而形成新的story。大家都是圆自己的故事，但是套路框架那是科学家们发明的，我们可以完全去借鉴。医生做科研在创新套路这件事情上面，如果我们在起步阶段就在琢磨，那是毫无必要的。所谓套路恒久远，主变量换着来，我们掌握了这样的思路之后，至少玩到国自然面上项目一点问题没有。缺氧-肿瘤细胞-外泌体携带一个miRNA-调控血管新生，这样的套路如果想用，直接从我们课程的范文里面直接借鉴就好了。就算是其他的一些表型要素要换一换也没关系，我们学会了这套思路方法，自己找典型的文章来移植数据格式就行了。我们学习一套正确的方法，就会带来成倍的效率提升。
