使用的文献：Long Noncoding RNA PICSAR Promotes Growth of Cutaneous Squamous Cell Carcinoma by Regulating ERK1/2 Activity
高通量筛选是有效的获得目标分子的方法
- 本篇文章中，作者主要采用了RNA测序的方法（转录组测序技术）
- RNA-seq技术的优点
- 高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本；
- 全基因组分析：无需预先设计特异性探针，能够检测未知基因，发现新的转录本；
- 检测范围广：同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本。
- RNA-seq技术的缺点
- 由于选择性剪切alternative splicing现象的存在，一个基因可能会存在多个转录本，就像“异构体”一样；这些“异构体”共享基因的部份同源性是非常高的，导致测序获得的这些异构体之间会形成“多元匹配”，这个多元匹配的问题是RNA-seq技术用于检测选择性剪切的基因的过程中需要攻克的难点
- 和基因组不同，转录组的存在在生物体的不同生命阶段是动态变化的
- 成本高
原位杂交技术
- 原位杂交技术的原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸（即探针）与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
- 探针的标记：
- 放射性标记物：3H、32P、35S、125I
- 非放射性标记：生物素、地高辛、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素（绿色荧光的FITC/红色荧光的罗丹明）
- 如果用荧光进行标记，那这个实验也可以称为FISH（F-Fluroscence
- 如果是检测RNA，由于RNA本身就是单链分子，不需要加热、变性和解链，因此这个过程会更加轻松一些（相比于检测DNA）
- 如果要通过ISH检测RNA，需要大家在取样、固定和后续操作过程中非常小心，因为RNA酶无处不在，任何疏忽大意都可能导致RNA的降解，导致实验失败
RNA-pulldown
- LncRNA常见的作用机制：通过和蛋白相互作用，介导下游的信号传递
- 从已知的LncRNA筛选可以与RNA结合的蛋白可以应用RNA-pulldown技术，其与普通的pulldown技术是非常相似的
- 首先，将LncRNA连接到磁珠上，然后将带有LncRNA的磁珠与胞浆蛋白孵育，以形成RNA与蛋白的复合物；通过洗脱，去除非特异性结合之后，就可以获得与LncRNA特异性结合的蛋白了
- 最后，通过wb或质谱对拉下来的蛋白进行坚定
- 研究RNA直接作用机制的常见方法
RIP
- 不是rest in peace，而是RNA Immunoprecipitation免疫共沉淀
- 通过抗体或者表位标记物，捕获内源性的RNA结合蛋白，然后通过免疫共沉淀的方式，把与RNA结合的蛋白同RNA一起分离出来
- 与蛋白相结合的RNA可以通过微阵列，定量PCR或者高通量测序的方法进行鉴定，RIP后通过芯片进行鉴定的，就被称为RIP-Chip技术；通过高通量测序进行鉴定的就被称为RIP-seq技术
- RIP的应用
- 已知蛋白，筛选能跟蛋白结合的LncRNA，后续常通过与Chip或测序技术联用鉴定LncRNA的序列
- 通过RNA-pulldown已经找到了能与RNA相互作用的蛋白，然后通过RIP验证筛选到的蛋白和LncRNA之间确实存在相互作用
组织芯片
- 英文名Tissue Array
- 是一种特殊的生物芯片技术，它可以将数十个甚至上干个不同个体的临床组织标本按预先设计的顺序排列在一张玻片进行分析研究，是一种高通量、多样本的分析工具。
- 本质是高通量的免疫组化
- 由于组织芯片上有几十，甚至几千种临床样本，所以在进行实验的时候，可以保证不同样本在相同的实验条件下进行操作，避免样本间的实验误差，能够获得更好的实验结果，也能显著提高实验效率
- 临床研究时，组织芯片常常和基因芯片、测序技术联用，可以极大地提高研究效率
- 传统的策略是通过基因芯片或者测序，获得显著差异表达的基因DEGs，然后在少量样本上进行表达验证，通过验证后的差异分子，然后进入表型和机制的研究，但这种只做一轮的验证的问题是只有少量的，经过样本验证的分子，在细胞层面上往往没有表型
- 改良后的研究模式：首先通过基因芯片或测序，筛选样本中有显著性表达差异的基因，这是第一轮筛选，然后挑选显著表达差异的基因在组织芯片中进行第二轮筛选，只有经过了两轮筛选的基因才能进行深入的表型、或者是机制的研究
- 采用这种方式的好处是：由于目标基因已经在组织芯片上验证了差异表达，具有显著的临床意义，即便分子没有表型和机制的相关研究，一样可以发表SCI论文；而且，在经过了两次筛选之后，在细胞中能够获得显著表型差异的基因的概率也会更高，可以提高我们的研究效率
