实验的设计逻辑
- 复习[三十六策 Lesson 9]功能基因五步法验证
- 先去做表达检测（功能基因的五步法相对简单，但是LncRNA需要做RNA原位杂交，就有点困难了）
- 做功能表型的验证：不要一个分子-一个表型去做，去选不同的几个分子对同一个表型这样分批做，“以通量换概率”。
- 一批里面选择3-5个分子，这样平行验证一次做掉的额外好处是可以批次内的分子互相验证，尽量保证有表型
- 实验环节制备RNA的技术可以交给公司，订购siRNA很便宜，而且包设计，完全可以批量一次定很多很多的siRNA，先用qPCR验证敲减是有效的，接下来可以尝试不同的表型，设计不同的实验，在有些模型里面，有些表型的呈现是通过Biomarker，那我们去检测这些Biomarker的变化就可以了
- 做完了细胞表型，接下来的几步就可以平行开展了
- 文章不需要发的很高分的话，机制可以简单做，动物实验之后补，大部份情况下动物实验是逃不掉的，因为Reviewer的套路是一个表型in vitro设计过关了，补上in vivo的部份才能彻底过关
- 这里根据疾病和表型不同，选择的细胞动物模型就有不一样的地方，按照套路常规配置就好
- 基础研究里的分子机制分为两种，分别是直接机制和间接机制，复习[三十六策 Lesson 11]的内容
* 这篇文章做的是间接机制，没有做分子-分子直接机制的内容
* 医生做科研做直接机制≈业余选手和职业选手过招，场面比较难看
* 间接作用机制做踏实了，文章IF也能上五分，从易到难一步步来
- Fig.3进行了这篇文章的第二次筛选，采用的方式是抑制剂筛选
- 虽然文章当中只提到了三款，但是现实中我们是不可能一猜通路就猜中的，所以需要至少做两轮
- 第一轮，各种明星通路的抑制剂都选一点，总有几个通路是值得往下做的，复习[三十六策 Lesson 13]中三种常见的筛选机制的方法，其中第三种就是通路抑制剂库的方法，推荐在实验室里备十几种常见的通路抑制剂，不管什么分子都筛一遍，提高筛选机制的效率
- 当然，直接做高通量筛选也是可以的，作者在Fig.5里展示了“土豪”做机制的手段，上来就做了RNA-seq，这是文章中第三处做筛选的策略，一般没钱的做个芯片就好了，再没钱还能用通路明星蛋白的抗体芯片，好歹也是个筛选
- RNA-seq是筛选目标分子的常见手段，但如果是用来筛选下游分子，那就只能用“钱多霸气”来评价了
- 这篇文章最出色的内容，就是围绕一个通路来做上下游
- 上游p38δ，下游ERK1/2，本来就是一条路上的，在这条路上插入一个新的分子，说这个分子也参与调节，这种思路是值得学习的
- 做间接作用机制还需要聚焦，不要不同通路的分子放在一起做western，结果显示什么都能调控=什么都没讲，文章的Fig.3在上游靶分子的位置还做了阻断，Fig.5在下游靶分子的位置也做了阻断，这就是间接作用机制能够提供的最高级别的证据了。这样一套做完，在逻辑上就已经比较让人信服了。
按照实验部份把文章的数据进行归类
- 深棕色的部份基本上是LncRNA必须要有的环节，在细胞和组织当中去检测表达情况，做体内和体外的功能表型验证
- 如果学会了HOTAIR[LncRNA研究套路 Lesson 1]，第一步就可以从文献里面挑选一些新报道的LncRNA，放到自己的体系里面做二次验证，只要能出表型（的改变），一篇SCI基本就有了，这是应急的做法，不做常规推荐
- 橙色的部份是加分项，自己做LncRNA的筛选，就摆脱了低级趣味，上来就可以表明手里有好牌，如果自己筛的东西还能加上大样本的验证，数据质量就更高了
- 有临床数据可以做统计分析，单独的表达检测+临床相关性分析也是可以发文章的，用临床数据草草了解的分子一般是表型验证通不过的，因为表达差异+表型不同的文章，这种数据不配上机制去发高分文章实在是可惜了
- 配不上表型的情况在基础科研中也是很常见的：表达有差异，但是表型通不过，没有特别好的办法，只能“快刀斩乱麻”“断舍利”。
- 在机制上动脑筋，直接机制太难承受不起的话，间接机制上做文章，实现分子的“一元三型”上下游调控模式，也是可以上五分的
LncRNA研究模式的路线图
预算充分的模式
- Step 1：高通量去筛选LncRNA，可以用RNA-seq，也可以用芯片
- Step 2：筛选到的分子去做表达验证，LncRNA可以用qPCR和原位杂交去检测
- Step 3：做过表达或者是沉默的载体，然后进行表型的分析，Gain-of-function和Loss-of-function的套路，细胞做完做动物，这步做完文章基本就稳了
- Step 4：锦上添花，重点攻克一下通路和机制，想办法把研究的靶分子和某些明星通路扯上关系，文章的可看性就不错了
- Step 5：下游去做western，找明星蛋白作为机制的研究，先筛选出一个通路，然后把这个通路的内容往深了去做，聚焦一个通路，把上下游的关键分子都找到，然后用阻断的方式去确定关系，这样的数据模式就比单纯show western来的更加有说服力
- 只做下游机制可能只有IF=3，上下游机制都做就可以期待IF>5了
与功能基因研究套路中一起分析
- 在[功能基因研究套路 Lesson 3]中，作者采用了一套临床相关性研究的研究规范，也就是“三表一图”。我们应该在各个套路中取长补短。
- 功能基因研究套路的组织样本分析标准，对于肿瘤研究的学员来说，应该是基本的要求。
- 中国医生搞科研，钱不一定多，但是样本一定多，从这个角度看，PICSAR这篇文章在临床相关性数据上还有很大的提升空间，除了检测靶分子PICSAR，机制里面出现的上下游分子（p38δ，DUSP6，p-ERK1/2）都是可以去检测然后做相关性曲线的，这样数据的丰满度一下子就上去了
- 在细胞水平的功能检测上，这篇文章做的也比较敷衍，按照功能基因研究套路的内容，过表达+RNAi，显然证据的强度会更加的严谨，而这篇文章只做了RNAi，没有过表达
- 增殖和迁移表型都可以用多个实验来验证，但是这篇文章也没有，急匆匆地做了一个就闪了，细胞实验部份可以借鉴的内容不多
- 分子机制层面，上游+下游+rescue，中规中矩值得我们参考
- Fig.6动物水平的研究，作者也是蜻蜓点水浅尝辄止，机制相关的指标也没有检测，这种有点偷懒的习惯真的不值得参考，不要有投机取巧的心理，把细胞水平的发现在动物水平好好验证一遍
关于预算
- 文章的投入至少在20万以上，一个项目花个30-40万如果能在本领域顶级期刊发一篇非常高分的文章，那也是很值得的
- 类比一个国自然项目，60-80万的预算，做一篇6分的文章花个30-40万，其他的七七八八凑一点总归有别的文章的，挂上基金号，结题是毫无压力的
- 为什么要做筛选：复习[三十六策 Lesson 8]的内容，通过通量解决概率的问题，规避客观程度上一定的科学风险和失败；当我们学会了这个原则，**用这个思路做科研的时候，文章不是一篇一篇做的，而是一批一批做的。
2万块的低预算课题
- LncRNA建议不要碰，建议搞临床标本大规模检测这种统计分析类的文章（诊断性临床研究的内容），基础科研四大金刚（功能基因、LncRNA、miRNA、转录因子）没有5万块真的好难搞定的
- 做到机制的时候，其实很多朋友已经做实验做到“强弩之末”了，满脑子都是怎么减配，上下游选一个，这种时候推荐先下后上的策略，至少来个蛋白芯片+western做做下游，已经是比较省钱的方案了
- 做基础科研的时候，学会预算上的“高配方案”，自己再根据实际情况去减配，操作起来会相对容易，不要一开始就想着比较轻松的方案
