转录因子研究套路 Lesson 3 通用研究设计框架

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转录因子

使用的文献：Thyroid transcription factor 1 enhances cellular statin sensitivity via perturbing cholesterol metabolism

整理数据结果的逻辑标签

Fig.1

• 针对主变量的表型研究

Fig.2

• 通过筛选脂代谢相关分子，锁定了ABCA，接着对不同细胞株里主变量和因变量的正调控关系进行展开，并且和前面一样，在最后进行反向的沉默验证
• 总结来说，这是对涉及因变量的二元变量调控关系进行讨论

Fig.3

• Fig.3与Fig.2是一脉相承的关系，从检测mRNA的水平到检测蛋白
  

Fig.4

• 直接机制的内容
  
• Luciferase+ChIP两个转录因子的经典实验
• 对启动子进行分段，验证结合区域以及结合的motif特性
• 推动了研究的深度

Fig.5

• 表型验证
  
• 把胆固醇外流这个表型放到机制之后研究（展示结果），从逻辑上来看是因为ABCA1这个基因在前面的内容中被证明和胆固醇外流相关

Fig.6

• 如果这篇文章不关注他汀药物的敏感性，那其实到Fig.5结束也是可以的，也是完整的故事
• 但表型与表型之间往往存在各种相关性，表型的cross-talk可以给课题增加层次感，另外引入药物敏感性的表型还能提升与临床的相关性，所以Fig.6可以看作锦上添花。
• 省掉了反向操作，补充了动物实验的内容
• 一般来说，表型嵌套是课题主体部份内容结束，想怎么能发更高水平的文章的时候补充的内容
• 我们吸收了这部份思路，可以为未来做跟药物可能相关的表型时，也把药物的敏感性或耐药的问题，自然而然地设计一个嵌套格式，实验不难，效果不错，性价比很高

数据结构总结

通用研究设计框架

一项完整的研究，数据可以来源于细胞、分子、动物和组织4个层面，其中细胞是根基，负责论证分子和表型的关系

细胞水平

• 这篇文章的细胞水平实验设计了一正一反观察胆固醇代谢表型，用了功能缺失的过表达载体做gain-of-function的对照，用了RNAi和CRISPR两种沉默手段，也是有亮点的地方
• 主变量的shRNA沉默再rescue回复，是很有诚意的论证形式，这些设计都没什么可挑剔的，我们可以学习这种多种手段证明同一个问题，不要怕麻烦，好文章就是工作量堆积出来的思路
• 从这篇文章我们可以学习大致的，胆固醇代谢表型的模-法-标套路，检测TC、FC和CE这三个biomarker的方法，以及用胆固醇外流作为细胞内胆固醇水平的细化表型
• 本文的细胞模型也有值得赞赏的地方，胆固醇代谢是一种正常的生理效应，而不是病理过程所独有，所以正常的肺上皮细胞模型的加入，可以让研究更加丰富，再加上研究有TTF-1阴性表达和阳性表达的细胞，就更加有说服力了
• 学完了这个套路，大家就请不要有“一两株细胞解决战斗”的流氓思路，先天不足后天是很难弥补的，等实验做完才想起来加个分组，这是很难操作的，只能重做一遍，所以最初的实验设计一定要严谨
• 这篇文章的基因操作手段也是较为丰富的，比前面两个套路都完整：一般而言，基因操作只需要做到一正一反，也就是过表达+RNAi就OK了，这篇文章在过表达里面还配了功能失活的载体，沉默策略也用到了进来比较流行的CRISPR基因编辑技术，其实TTF-1resxue的载体也是需要做突变调整的，全部都是工作量确实不容易。
  

分子水平

• 既然已经确定了表型，围绕表型来筛猜下游调控分子是比较聪明的办法
• 脂代谢的84个关键分子可以看作某种通路，我们始终要记得pathway是一个拓展过的概念，不仅仅指万金油通路，表型背后一堆堆的Biomarker也因为有上下游串联的作用，构成了通路，这些通路有商业化的产品，供我们进行定向筛选，避免全表达谱盲目筛
• 本质上，找靶分子的策略和前面的套路课没有太大的差异
• 主变量，因变量调控关系的证明也和前面的文章是类似的，操作主变量TTF-1，观察因变量ABCA1的mRNA和蛋白水平的变化，比较遗憾的是没有rescue，注意转录因子直接作用的内容是不能替代rescue验证的，有结合并不意味着主变量对于调节表型一定是必要的。

动物水平和临床研究

• 堪称轻描淡写，毫不在意，浑水摸鱼
• 这两部份这篇文章没有任何可以借鉴的地方，动物实验的药物敏感性只做了过表达，把沉默都给省了，这都能省？？？
• 而且表型嵌套应该有上下游调控的rescue实验设计，也就是”我不动，你动也白动“的内容，这部份的实验难度不大，但是对于文章结论的推导是不可或缺的。除了这些实验应该在细胞水平补充以外，动物水平也应该做，这样数据才更加扎实
• 临床样本常常是科学家研究的痛点，需要找合作伙伴才有，也就是说医生搞科研还不善加利用标本=暴殄天物，医生可以考虑用临床标本资源换基础科研老师做分子交互机制的能力，这也是合作共赢的思路
• 说回这篇文章，本课题里要把胆固醇代谢和药物敏感性联系起来，我们可以检测人血清胆固醇标志物的表达，看他们与他汀类药物敏感性之间的关系，同时也可以按照“三表一图”的套路，分析组织标本中TTF-1表达和肺癌病理特征，包括他汀敏感性的相关性
• 肺癌是比较容易取到组织标本的，检测标本中TTF-1表达和ABCA-1的表达有没有正相关也是一组不错的证据。