转录因子研究套路 Lesson 16 文献中使用的CRISPR-Cas

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转录因子
CRISPR-Cas

使用的文献：Thyroid transcription factor 1 enhances cellular statin sensitivity via perturbing cholesterol metabolism

• 在示例文献中作者采用了CRISPR-Cas9系统来删除目的基因上的一段DNA，在目标DNA序列上造成两个缺口，从而删除了大约160bp，达到破坏基因功能，实现基因敲除的一个目的。

实验原理

• 这个系统的工作原理如图所示，在基因的上下游各设计一个gRNA，gRNA1和gRNA2，将它与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，gRNA就可以通过碱基互补配对就可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使基因上下游的DNA双链断裂，这样中间这一段DNA就会被删除了。如果这一段位于基因的关键的功能结构编码区，基因的重要功能就被破坏了。随后细胞内的DNA断裂修复机制就可能将断裂的两端强行连接起来，或者可以在此基础之上引入一个修复的模板质粒，这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或者是定点突变，实现基因的替换或者突变。

实验流程

• 如果使用这个系统，那么进行实验的流程会有少许变化。
• 首先也是要设计gRNA，但gRNA是要设计两条，并且这两条gRNA相距最好不要太远甚至可以在想要进行编辑的区域设计一堆gRNA。
• 接下来仍然是构建载体和共转染细胞，为了提高效率可以先构建Cas9过表达的稳转细胞，然后再往这个稳转细胞中转染gRNA。
• 转染之后需要去鉴定一个混合的细胞，但是这里的鉴定就不用酶切法了，因为直接删除了一段DNA，可以直接用PCR去鉴定，把PCR之后的产物去跑琼脂糖凝胶电泳就可以看出来的比酶切方法要方便多了。
• 在初步鉴定之后，确认了转染进细胞的各种组分能够对基因组进行精准编辑了，就可以加以筛选，将编辑成功的细胞克隆化，形成单克隆细胞株；筛选出来的单克隆细胞仍然要进一步进行鉴定，可以用PCR后送测序的方法鉴定看缺失了哪些碱基。如果不缺预算，也可以去做全基因组的测序，看看是不是有脱靶。

数据分析

• 无论是单克隆还是混合克隆，都是将细胞抽提基因组DNA，然后进行PCR扩增-跑胶-看条带。PCR的引物要跨编辑区域进行设计，跑胶的结果如下图所示。杂合的细胞能够跑出两条带，纯合型的细胞能够跑出一条比较大的带，被编辑成功的纯合细胞也是跑出一条带，且跑出来的条带会比纯合型的短一截。

常见问题