使用的文献：Thyroid transcription factor 1 enhances cellular statin sensitivity via perturbing cholesterol metabolism
- 这篇文章明显是做转录的，因为它把转录因子放在最显眼的位置。我们要介绍的第一个技术是EMSA。EMSA它的中文名可以叫做凝胶迁移，或者电泳迁移律试验，也可以叫做J-Shift，它是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的一门技术，它可以用来定性和定量分析。
- 这一技术最初是用于研究DNA结合蛋白的，目前也可用于研究RNA结合蛋白，和特定RNA序列的相互作用。这个技术在我们这篇实验文章中并没有出现，但它是研究转录因子的经典实验技术，它能证明转录因子蛋白与转录因子的Binding Element这段DNA序列的直接结合。在证明直接调控机制的时候，可以大显双威。别看这篇Oncogene有七分多，缺了EMSA这个机制证明也是丢失影响因子挺多的。
- 言归正传，EMSA实验的讲解分为四部分，实验原理、实验流程、数据分析和常见问题。那后面的ChIP实验和GRISPR-Cas9的讲解也会分成同样的这四个板块来讲解。
实验原理
- 我们知道转录因子是蛋白质，它如果能调控某个基因表达的话，就能结合到这个基因的启动子区域；基因启动子是双链的DNA分子。
- 如果某个转录因子X能跟某个基因Y的启动子区内的一段DNA结合，就能说明这个转录因子X能够去直接的调控基因Y的表达。EMSA实验要根据基因Y的启动子DNA序列来设计探针。探针也是一段DNA双链，序列中要包含转录因子的结合序列。探针是带标记的，这个标记可以是放射性的32P，也可以是非放射性的生物素或者地高辛。
- 当DNA探针与样本蛋白混合孵育的时候，样本内如果含有可以与探针结合的蛋白，它就可以与探针形成一个蛋白-探针复合物，这种复合物它的分子量就比较大了，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳的时候，迁移的速率就比较慢，而没有结合蛋白的探针就很快的会跑下去。
- 我们把样本进行聚丙烯酰胺凝胶电泳之后转模，再用显色剂跟探针上的标记反应，把探针的位置给显示出来，这样没有结合蛋白的探针分子量小，它们会跑得非常快，这种没有结合蛋白的游离探针所形成的条带就会靠近膜的下边缘，而蛋白探针复合物显示出来的条带会在上面。一般我们探针都会加过量，所以就算是结合的这一组，在膜的下边缘也会出现大量的游离探针。
- 上面就是一个shift的条带，最下面就是都是游离探针的条带。如果在靠近膜的上面出现条带，那就说明蛋白与目标的探针是可以结合的，它们之间有相互作用。当检测转录调控因子这一类的DNA结合蛋白，我们可以用纯化的蛋白，也可以用部分纯化的蛋白，或者用细胞核抽提出来的蛋白。
- 如果是用纯化的转录因子蛋白去做EMSA，那就可以排除其他分子的干扰，检测出来的蛋白DNA探针结合就是一个直线结合
- 如果是用部分纯化的蛋白，或者是细胞核抽提出来的蛋白，那就很难说明它们是一个直线结合，因为有可能有第三者第四者这种小帮手存在，去帮助这个转录因子蛋白和DNA探针去发生结合
- 在实际的实验过程中，为了证明转录因子蛋白与目的基因DNA序列的结合的特异性，需要做非常多组的对照。一个经典的EMSA实验，除了常规反应外，还需要阴性对照、探针的冷竞争反应对照、突变探针的冷竞争反应对照以及super shift对照。我们先看一下图例：
- 阴性对照：只拿探针去跑电泳，这一组是没有经过蛋白质和探针孵育的。
- 探针的冷竞争反应：先拿未标记的探针去跟蛋白孵育，这样未标记的探针就会优先与蛋白结合，又因为通常探针都是过量的，这样拿未标记探针和蛋白孵育完成后，应该结合上未标记探针的转录因子蛋白肯定就被结合掉了。能多下来的蛋白肯定就是不能跟这段探针训练结合的其他蛋白，这时候再加入标记的探针，就没有转录因子蛋白可以与标记探针结合了。这一组探针冷竞争反应的对照目的在于说明这段探针是特异的跟转录因子蛋白结合的，而不是随随便便就能跟任何蛋白结合。
- 突变探针的冷竞争反应：先拿未标记而且突变的探针去跟蛋白孵育，注意未标记的突变探针不能与转录因子蛋白结合，此时再加入标记的探针，标记探针就能与目的转录因子蛋白结合上了。这一组对照呢也是说明探针序列跟转录因子蛋白的结合是特异的，而不是说随随便便一段DNA探针就能够与目的蛋白结合。
- SuperShift反应：这组对照在进行探针蛋白孵育的时候，还加入了转录因子蛋白的抗体。这样得到的探针-转录因子蛋白-转录因子蛋白抗体是一个更庞大的复合物，所以这一组会在聚丙烯酰胺凝胶中迁移的最慢。这一组也是为了说明特异性，具体来说与探针结合的转录因子蛋白就是我们要求检测的目的转录因子蛋白，而不是其他蛋白。
- 阴性对照它只有探针，探针的分子量是最小的，就会跑到最前面。
- 常规反应中，标记的探针会和转录因子蛋白结合，就会跑得靠后一些。
- 常规的探针的冷竞争反应：未标记的探针和转录因子蛋白结合，标记的探针因为没有结合到，所以它会跑到前面
- 突变探针冷竞争反应：未标记的突变探针因为没办法跟蛋白结合，所以会跑到最前面；标记的探针是可以跟蛋白结合的，所以它会跑到后面
- Super Shift：探针-蛋白-抗体三者结合，分子量特别大，它是跑到最慢的跑到最后面。
- 因为探针是过量的，每一组都会有大量的游离探针在跑在最前面。
- 最后显色出来的条带就如图上所示：有Shift条带，Super Shift条带，也有大量的游离探针的条带。
实验流程
- 首先要配聚丙烯酰胺凝胶：这个胶跟做Western的胶是不同的，Western的胶它是变性胶，而且是分层的，这个EMSA胶是非变性的。
- 配完胶之后需要进行预电泳：通过预电泳去把凝胶里的孔洞给疏通一遍，在预电泳的时候，我们可以一边预电泳，一边配置各组反应。
- 正式电泳
- 在正式电泳之后转NC膜，并且用紫外交联把探针固定在膜上。
- 最后进行显色，可以用ECL发光，然后扫膜或者是X光片，压片、洗片。
数据分析
- 我们通常是做定型分析，看看条带的有无。有时也可以做定量分析，分析一下条带的灰度值来判断结合的强弱。
常见问题
- 关于探针：一般来说非放射性标记的探针会稍长，放射性标记的探针可以稍微短一些
