功能基因研究套路 Lesson 8 文章数据剖析

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文献范例：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26565812/

Fig.1当中，作者希望通过一系列的实验，告诉我们CISD2这个基因在胃癌组织中高表达，而在癌旁对照组织中表达很低

• a图中，作者从TCGA数据库收集了相应的CISD2表达数据，根据作者的报道，作者收集了409例胃癌标本，37例癌旁对照的正常组织标本；通过数据分析，作者发现，CISD2在肿瘤组织中的表达，要显著高于CISD2在癌旁对照组织中的表达
• b图中，为了消除个体的差异性，研究人员挑选了成对的33例组织样本，证实了在这33对组织样本中，CISD2在其中的25例癌组织中高表达，而在癌旁对照组织中低表达
• 随后，作者在c图和d图中，通过qPCR和western，证实了在胃癌细胞系中，CISD2在mRNA和蛋白水平的表达，都比正常细胞的表达要高，因为在后续的研究中，研究者对这个分子做了过表达和RNAi，所以在这里，作者选了两株CISD2分子表达量比较“中庸”的分子进行表达细胞功能学实验
• 在选择细胞株的时候，后续的原则是，如果要做敲减实验，那么就选择细胞株内高表达目的基因的细胞株，反之亦然。对于既要做过表达，又要做RNAi，即可以选择目的基因表达比较一般的细胞株（本文的选择），也可以选择在过表达中选低表达目的基因的细胞株，反之亦然
• e和f图中，作者同样证实了在自己收集的5对临床配对样本中，CISD2的mRNA和蛋白水平在癌组织中的表达，比癌旁组织中的表达更高
• 在Fig.1b中，癌和癌旁之间的比较，正常情况下可以用柱状图来进行表示，但是因为作者选了33对临床组织样本，如果要把这堆样本全都用柱状图来表示，那柱子的数量就太多了，显得整张图非常局促，影响视觉上的效果；作者采用颜色来显示表达，显得图片相对精美一些，这种左图思路值得借鉴
• 在Fig.1a中，作者选择了409例癌组织，但是对应的癌旁组织仅有37例，这是一个非常奇怪的现象，可能引起审稿人的怀疑；建议我们在展示数据时，无论是自己收集的病例，还是从公开数据库下载的病例，都要让对照样本和肿瘤样本在数量上差不多，避免出现相差了几倍，甚至十几倍的现象

作者在Fig.2中研究了CISD2的表达差异与临床预后的相关性

• 作者总共收集了210例石蜡包埋的正常胃组织和胃癌组织的样本，通过免疫组化IHC，在这些胃和胃癌组织上，进行了CISD2的表达检测，IHC的结果显示，CISD2在正常胃组织，或者比较早期的胃癌组织中低表达，在晚期胃癌组织上表达很高，呈现出从正常组织到晚期的胃癌组织，表达不断上升的趋势
• CISD2随着胃癌恶性程度升高而表达增加的趋势，提示了CISD2在胃癌发生过程中可能起到了癌基因的作用
• 图d的生存曲线，作者把患者分成了高表达CISD2组和低表达CISD2，其中高表达CISD2的患者预后显著小于低CISD2组
• 图b是一个体系验证结果，在没有加一抗的条件下，是没有CISD2的阳性结果的；体系验证的结果对文章的证据没有重大影响，完全可以考虑放在补充材料中，而且这张图很可能是审稿人要求作者后补的
• 对于实验结果是应该放在正文中，还是应该放在补充材料中：对于文章的结果导向有重大影响的，应该放在正文中，反之没有重大影响的，放在补充材料中就可以了

和临床相关的数据表格

基因表达检测

• 基因表达检测的常用方法
  
• 作者在检测mRNA水平的内容时，使用了qPCR和基因芯片两种方法，基因芯片没有直接用，但是文章里用到了TCGA数据库下载的文章，这也是基因芯片的内容；其他的方法还有rtPCR（逆转录PCR），这种检查方法只能半定量地观察细胞中基因的表达量；Northern blot的原理是使用与待测序列互补的探针，随后通过检测探针与待测序列互补结合来怕断结果，Northern最大的问题是实验流程长，而且早期的Northern使用放射性同位素，对人的身体伤害比较大
• 在研究tRNA和rRNA时，Northern依然是很有用的方法
• 相比qPCR，Northern的好处是，它可以检测的序列非常长，最多可以到十几个kb的水平
• 对于蛋白水平，作者采用了western和IHC，IHC的好处是可以同时观察到蛋白的表达量和蛋白的亚细胞定位
• 其他检测蛋白质的方法：2D-gel，是同时利用了蛋白质分子大小和所带电荷数的特性，可以更好，更精细地区分不同蛋白质之间的差异
• 免疫荧光也是主流的检测蛋白表达水平的方法，但这篇文章中作者使用的是免疫组化，这俩的原理是一致的，差别在于检测免疫荧光用的二抗有一个荧光基团，可以检测荧光强弱的变化，大部份情况下免疫组化就足够研究蛋白的表达量了，但是，如果要研究共定位的话，免疫荧光具有更大的优势，因为免疫荧光可以进行两种颜色的共定位-双标研究
• ELISA：常用于小分子分泌型蛋白的检测，可以直接取用细胞培养的培养液进行ELISA检测，而且ELISA检测的敏感性也比较高，一般情况下没有必要对培养液进行浓缩
• IP：免疫共沉淀，不是用来检测蛋白的常用方法，但是对于检测某些分子的特殊修饰，比如磷酸化修饰是非常有意义的；对于那些没有磷酸化形式的特异性抗体的，先通过免疫共沉淀的方式把所有的分子都拉下来，无论是磷酸化了的还是没有磷酸化的，然后再这一群拉下来的分子中，再通过泛磷酸化的抗体，检测目的分子

作者在细胞和动物层面研究CISD2对肿瘤细胞表型的影响

• 作者首先做了GSEA的分析，发现CISD2的表达水平，和细胞周期相关的基因子集具有高度的表达相关性，由GSEA的分析结果，作者可以得到的是CISD2可以影响的是细胞的周期以及分裂
• 为了验证上述假说，作者首先构建了CISD2的过表达质粒和敲减质粒，然后证明了这些质粒都是有用的
• 然后作者通过经典的克隆形成和MTT比色法的实验，分别检测了过表达和沉默CISD2后，细胞增殖以及克隆形成收到的影响，结果显示CISD2过表达的组增殖能力增加，反之亦然
  
• 在Fig.4中，作者采用了锚定非依赖的增殖实验，这是利用了肿瘤细胞不需锚定基质，就可以进行显著增殖的现象，在肿瘤细胞内提高CISD2的表达水平，肿瘤细胞这种锚定非依赖的增殖能力就获得了极大的提升，反之亦然，这个实验充分说明了表达CISD2水平的高低和肿瘤的增殖能力有直接的相关性
  
• 在做完了离体的细胞实验后，作者选择了在体的动物实验，但是只做了CISD2敲减情况下的动物模型验证，敲减CISD2后，能在小鼠体内形成的肿瘤组织体积会明显减小，重量也减轻了
• 在移植瘤实验结束后，获取移植瘤匀浆样本，再进行western检测，发现RNAi的效率可以持续到整个实验的结束
• 通过移植瘤组织进行IHC研究，也可以发现CISD2在对照的移植瘤内高表达，而在敲减的移植瘤内表达明显降低，和CISD2表达高低抑制的，是肿瘤增殖的标志物Ki-67
• 在细胞层面上，作者同时做了高表达CISD2和低表达CISD2两组的结果，但是在动物模型上的研究就只有敲减CISD2的了，这主要是因为动物模型工作量巨大，能够仅通过敲减CISD2这一个实验就证明CISD2的癌基因功能，在一般情况下，审稿人不会过分要求，不是非要在在体层次上重复离体细胞实验的结果
• 作者在本项研究中进行的RNAi方法，不是常规的慢病毒敲减方法，而是逆转录病毒介导的RNAi敲减的方法，因为和慢病毒相比，逆转录病毒只有在细胞分裂的时候才会产生作用，细胞不分裂的时候是无法发挥作用的，慢病毒则不会受到细胞分裂的影响

作者进行机制研究

• Fig.5证明了CISD2可以影响肿瘤的细胞周期调控，尤其是影响细胞的G1/S期转化
• 作者首先进行了BrdU染色实验，BrdU阳性的细胞是进行了细胞分裂，且有DNA复制的细胞，实验中总的细胞数可以通过DAPI染色显示，因为DAPI是一种核染料，可以把所有的细胞核都染色
• 在CISD2过表达情况下，BrdU阳性的百分比会显著提升，说明发生细胞分裂和DNA复制的细胞百分比显著上升，反之亦然
• 作者接着通过流式细胞术对肿瘤的细胞周期进行了更加细致的分解，在CISD2过表达的情况下，S期的细胞会有明显提升，相应的G0/G1期细胞比例下降，反之亦然，所以说流式细胞术证明了CISD2调控了细胞G1/S期的转化过程
• 最后，作者通过Fig.5d和5e，从mRNA水平和蛋白水平，验证了和细胞周期相关的，调控分子的表达的高低，作者的实验结果证实，p21/p27/cyclin D1明显收到了CISD2的调控，但是其他分子，如cyclin B1/CDK4/6没有受到CISD2表达的影响
• 作者选这几个分子是因为cyclin D1/CDK4/6是有大量文献证明参与了G1/S期转化的，cyclin B1介导了G2/M期转化，p21和p27是在细胞周期中重要的负调控分子，所以在CISD2过表达的情况下，p21和p27的表达是受到抑制的，反之亦然
  
• 通过Fig.5，作者证实了CISD2影响cyclin D/p21/p27，进而影响细胞周期，于是在Fig.6继续对这条信号通路进行了挖掘
• Fig.6中，作者依然首先通过GSEA的分析方法，发现CISD2的表达与AKT，以及FOXO3相关的基因子集之间，有高度的富集现象，所以作者就把研究重点聚焦在了AKT-FOXO信号通路上
• 通过western也证实了，CISD2过表达后，AKT的磷酸化增加了，FOXO、FOXO-1、FOXO-3a的磷酸化都增加了，相反，如果削减CISD2的表达，AKT的磷酸化， FOXO-1、FOXO-3a、FOXO-4的磷酸化水平都会显著受到抑制
• FOXO家族的4个成员是：FOXO-1、3、4、6，在这个实验中作者只检测了FOXO-1、3、4，没有检测FOXO-6，这里可能引起审稿人的怀疑（为什么不检测FOXO-6，还是FOXO-6的数据做出来不好看，所以没有放上去）
• 一个复习：没有被磷酸化的FOXO才可以进入细胞核内，调节基因的表达；p-FOXO无法进入细胞核，也就是说FOXO的磷酸化水平和其进入细胞核，调节基因转录的能力成反比；在FOXO的磷酸化水平提升后，通过荧光素酶实验可以发现，FOXO reporter activity是明显下降的，这一结果充分证明了FOXO的磷酸化水平和其进入细胞核，调节基因转录的能力成反比
• 在验证完CISD2与AKT-FOXO信号通路之间的相关性后，作者提出一个隐含的假设：CISD2可以调控下游的AKT-FOXO信号通路，同时CISD2也能影响增殖和细胞周期的表型，所以作者的隐含假设是：CISD2通过影响AKT- FOXO信号通路，影响肿瘤增殖和细胞周期表型
• 为了验证这个假设，作者阻断了AKT信号通路，验证CISD2引起的表型，是否可以因为AKT信号通路被阻断而阻断，如果CISD2引起的下游效应很大程度上依赖于AKT信号通路，那么AKT信号通路阻断后，CISD2的下游效应也会消失
• 作者通过MTT比色法和锚定非依赖的增殖实验，以及细胞周期实验，都证实单独过表达CISD2可以显著引起肿瘤细胞的增殖，以及导致锚定非依赖增殖现象的升高，但是只要阻断AKT信号通路，CISD2引起的增殖就会受到抑制，锚定非依赖的增殖效应也会受到抑制，发生S期周期阻滞的细胞比例下降，这些结果都证明，CISD2确实通过AKT信号通路，介导了肿瘤细胞的恶性增殖表型
• 最后，作者证实了，在使用了AKT抑制剂之后，p21/p27的表达都是显著升高的，而cyclin D1的表达是显著降低的
• Fig.6主要证明了CISD2的下游效应是依赖AKT信号通路的，但是整个实验的逻辑不够严谨
• 通过之前的实验，作者证明了CISD2可以影响细胞的周期和增殖表型，CISD2可以调控AKT-FOXO信号通路，所以作者自然而然就会形成一个思路，也就是CISD2通过AKT-FOXO信号通路，介导了肿瘤增殖和细胞周期表型
• 但是，作者为了阻断AKT-FOXO信号通路，选择的是AKT的抑制剂，这里的问题是AKT下游介导的信号通路是非常复杂的，FOXO只是其中一个信号分子，还有mTor，VEGF-MAPK，NF-κB，甚至是AKT直接抑制p21/p27，所以很难解释Fig.6g中，AKT被抑制剂抑制后，细胞中p21/p27表达升高到底是因为什么（AKT直接影响p21/27，还是AKT通过FOXO间接性影响p21/27）
• 所以，如果要验证AKT-FOXO的功能，选择FOXO的抑制剂可能比选择AKT的抑制剂更好