GSEA介绍
- Gene Set Enrichment Analysi，即基因富集分析
- 博劳德研究所（Broad Institute）开发的，针对全基因组表达谱芯片数据进行分析的工具
- 综合了现有的，对基因的定位，性质，功能和生物学意义等信息的基础上，构建的分子标签数据库（MSigDB，molecular signature database），在该数据库内，设置了多个功能基因数据的子集
- 在对全基因组表达谱芯片数据进行表达分析分析的时候，首先确定分析的目标，然后从MSigDB中，选择一个或多个功能基因集进行分析，再将经过标准化处理的数据进行表达值大小排序，最后比较这些基因与选择的功能基因的子集的符合程度，从而发现研究的目标基因表达谱数据，是否在选定的功能基因子集中有某种共同表达的趋势，最后给出富集分数
- 可以考虑让专业的数据公司帮我们完成GSEA数据分析的内容，“让专业的人做专业的事”，但通常需要额外收费
GSEA分析的特点
- 分析的是基因集合而不是单个基因（GO）or 少数基因（Pathway），可以获得的信息更加接近细胞内的，真实的生物学状况
- 将基因与预定义的基因集合（MSigDB）进行比较
- 富集分析
GSEA预先设定的基因子集
H-Hallmark Gene Sets
C1-Positional Gene Sets
C2-Curated Gene Sets
- 共识基因集合，数据来源主要是信号通路，文献报道的信息
C3-Motif Gene Sets
C4-Computational Gene Sets
- 计算基因集合
- 主要研究生物信息学的小伙伴会用的非常频繁
C5-GO Gene Sets
C6-Oncogenic Gene Sets
- 癌症特征基因集合
- 直接来源于肿瘤相关的microarray的数据
C7-Immunologic Gene Sets
GSEA分析的关键参数
ES值：富集分数
- GSEA分析得到的原始结果，反映了把全部的杂交数据排序之后，在此序列的前部或者后部，一个功能基因子集的富集程度
- 扫描排序序列时，当出现一个功能基因子集的基因时，ES值上升，反之下降，所以ES值是一个动态变化的数值，在一般的数据图片中，是不会标注ES值的，如果一定要标注，那图片中只会标注出最大ES值
- 上图中绿色的线就是ES值的标准变化曲线，ES值在不同的位置，数值是不一样的
- 对于一张完整的GSEA数据图片，图片的上半部份可以看到是一条ES曲线，中间部份有一根根竖线，这些是这条信号通路当中，出现在芯片数据子集的基因所处的位置，整张图片最下面的部份是杂交数据的排序序列，总共三张图组成
NES值
- normalized enrichment score，标准化的富集分数
- 在比较芯片数据集在不同功能基因子集的富集程度时，需要对ES进行标准化处理，NES是一个数值，是不变的
FDR
- False Discovery Rate，错误发现率
- 描述的是估算的可能性，也就是当一个功能基因子集的NES确定之后，判断其中包含的，错误的阳性发现率
- 举例：FDR=25%表示在特定的ES值下，四次当中就可能出现一次错误
- 在GSEA分析中，越小越好
p值
- 只是名义上的统计显著性
- 通常关注的是p<0.05，但是在GSEA分析中，只看p值会有很大的问题，因为FDR进行了功能子集基因大小，以及多重检验的矫正，而这些矫正在p值中是没有进行的，所以p值仅仅称作名义p值
- 特殊情况：p值很低，FDR值很高，这说明和其他功能基因子集相比，着重研究的基因的富集程度没有想象中那么高
- 基因芯片数据的样本量太小
- 杂交信号弱
- 所选的功能基因子集没能很好反映样本的生物学意义
Anchorage-independent Growth Assay
- 非贴壁生长实验/非依赖锚定的增殖实验
- 从原理上讲，就是传统的克隆形成实验的”3D培养版本”
- 对于传统的克隆形成实验，就是把肿瘤细胞的密度种得很低，使细胞和细胞间没有黏附，也没有信号传导，这样单个肿瘤细胞形成的克隆就可以计数，可以评估肿瘤细胞形成克隆的能力
- 肿瘤细胞和正常细胞存在区别：肿瘤细胞可以不依赖黏附就形成增殖，而正常细胞必须依赖黏附，为了区分肿瘤细胞和正常细胞对于黏附的依赖程度，所以就就依赖于传统的克隆形成实验，开发了这种锚定非依赖的克隆形成实验
- 琼脂的特性：比较高的温度下融化，比较低的温度下凝固，1%琼脂区域在凝固后，可以形成比较坚固的结构，为整个实验提到支撑的作用
- 0.3%琼脂的培养基：浓度比较低的培养基，这种培养条件下琼脂呈现出半流质的状态，可以让肿瘤细胞在这种环境中生长、增殖，而且氧气在这种浓度的琼脂培养基内很容易发生渗透，为肿瘤细胞的存活、生长和增殖提供养分
BrdU染色实验
- BrdU是胸腺嘧啶衍生物，在结构上与胸腺嘧啶是非常类似的，在细胞分裂时，BrdU可以替代胸腺嘧啶T，被整合到新合成的DNA链中，并存留在基因组中
- 在随后的实验中，可以通过抗BrdU抗体，识别这些新合成的，且有BrdU渗入的基因组，最后通过荧光检测，统计BrdU阳性的细胞，提示这些细胞发生过增殖和分裂
荧光素酶报告基因实验Luciferase Assay
- 在这个实验中，首先要构建一个质粒，质粒中含有荧光素酶基因，基因的上游是克隆一段想要探究的转录因子的结合域，在本篇paper中，克隆的是FOXO基因的结合域FOXO Binding Domain，FOXO转录因子可以结合在这段序列上，启动下游的基因转录
- 这样，细胞内就产生了荧光素酶蛋白，这个酶可以催化底物的降解，产生的荧光的强度可以通过酶标仪读出，通过荧光的强度来反映细胞内FOXO和FOXO binding domain结合与调控的强弱
- 对于荧光素酶实验，除了用来研究转录的强弱之外，还可以用来研究microRNA
- 对于microRNA研究而言，研究也从构建质粒开始，但是这个质粒的结构与前面的转录因子研究有差异
- Luciferase mRNA的上游是普通启动子，但下游要把miRNA的潜在靶点3’-UTR序列克隆到荧光素酶基因的下游
- 在没有miRNA的情况下，启动子的启动可以正常开始Luciferase基因的转录和翻译，产生Luciferase蛋白，进而产生荧光；如果细胞内存在miRNA的过表达，Luciferase的mRNA可以正常产生，但其可能被对应miRNA抑制功能或直接分解（因为这条mRNA上有miRNA对应的3’-UTR序列），不管是哪一种机制，都会导致Luciferase蛋白的含量显著降低，导致酶促反映的荧光读值降低，证明miRNA可以与我们引入的某个基因的3’-UTR区域发生特异性结合
- 如果要设计这个实验的rescue实验，就可以把miRNA结合的3’-UTR的序列做几个点突变，让miRNA不能再识别，如果实验作出来荧光的强度恢复了，那么就说明miRNA与target 3’-UTR直接的结合是特异性的
