如果我也要做一样的研究，数据、模版和套路应该是怎么样的？
- 学习一篇顶尖的paper，一大半设计都可以临摹
论文的数据来源
- 如果我们自己开展课题，也可以从这四个方面进行功能基因表达水平的检测和分析
- 只要做的疾病是有人的组织和样品的，这套模式就适用；就算没有专门的疾病数据库，也可以从别人做的高通量文章里面去查目的基因表达的情况，只要我们能取到组织，就一定有我们以外的人会去做筛选
- 如果蛋白是分泌型蛋白，那我们就可以考虑从血液/尿液等地方获取到标本，体液中的检测是可以作为疾病的biomarker的，有临床意义
- 过表达+细胞干扰看表型，这是一个功能基因研究必不可少的核心内容
- 基础研究主要关注的就是细胞和分子，没有细胞模型=巧妇无米之炊
- 过表达+干扰和细胞模型+动物模型双重验证，都是基本套路
- 机制的内容，是围绕表型服务的，用来解释为什么分子具有这种功能的原因，只要开始做机制，就具备了发IF=3以上的文章的潜力
- 检测下游通路明星分子的变化——miRNA用qPCR，蛋白用western，注意这种时候要以通量换概率，甚至可以用通路芯片筛
- 高级一点，就是所谓的“狙击”，与其关注目的基因能调控一堆明星分子，不如说清楚目的基因对一个分子的调控作用；入门的“狙击”可以从做rescue验证开始，用通路抑制剂二次验证
标签化的数据来源
生信分析
- TCGA分析基因表达的差异
- GSEA分析分子表达的差异与通路的相关性，为机制研究提供方向
检测组织标本中CISD2的表达情况
细胞功能和动物表型
机制实验
- 机制研究也是细胞水平展开
- 如果在做细胞表型验证的时候，把做了过表达和RNAi的样品留下来，再进行下游信号通路关键分子的检测，用同一批样品可以更好地保证结果的可靠性
自己的课题怎么设计
- 想简单做机制——western，数据质量高一些可以加上通路抑制剂的rescue实验，再深入的部份就要回答分子具体怎么调节另外一个分子的问题，这个见后
- 没有自己的样本——数据分析+细胞动物实验
- 不想做动物——细胞表型+机制就投稿
- 细胞动物机制都没有——有很多临床样本+好好分析，说不定也能投
- 三十六策Lesson 9中有功能基因研究的基本的五步骤
- 基础表达检测：细胞和组织的，也包括从数据库里做表达的差异分析，目标是得到表达差异和临床相关性的证据
- 制备基因操作工具
- 质粒、病毒
- siRNA
- 一般交给公司来做
- 验证过表达和沉默的效率（qPCR和western）
- 功能表型实验：筛的时候去找多一点的表型，确认了之后针对一个表型去做更加深入的，二次实验验证
- 如果希望文章有更高的IF，可以用两株细胞相互佐证，一个表型至少要有2种实验相互佐证，这样严谨性会更好，rescue也能更好
数据库部份值得学习的地方
- 我们自己设计课题，数据库部份也要尽量能回答这四个问题
- 先学这么一套，后面学数据怎么根据临床问题分层分析
- 文章不足的地方：机制里做了p-AKT，题目里也提了AKT pathway，但是AKT的变化在标本中没有验证，如果能在人的标本中，把CISD2的高表达和AKT的表达情况做相关性分析，对于整个文章提出的科学假设，说服力会更高
细胞实验值得学习的地方
- 多株细胞的基础表达检测，后面可以选择表达高的细胞干扰，表达低的细胞过表达
- 在基因操作上，文章有过表达和RNAi一正一反的验证，这也很好
- 大部份作者的常规简化处理方式：选择促进疾病发展的因素（目的基因在疾病发展中高表达）去做RNAi，选择保护性的因素（目的基因在疾病发展中低表达）去做过表达，把RNAi省略掉
- 这篇文章的操作：两株细胞，两个靶点，多个表型实验平行验证，没有刻意去省工作量
- 机制研究：rescue验证
动物实验
- 这篇文章仅仅验证了增殖的表型，而且只做了RNAi的方向，省掉了一半的工作量
- 对于下游的Akt以及通路蛋白变化，以及抑制剂的rescue表型，作者没有验证，随风飘过了
- 想发更高水平的文章，体外实验当中的主要结论在体内模型中都是要验证的，这样才更加有严谨性
实验设计框架——填空题
- 第一部份是组织水平水平的内容——样本资源
- 输出三表一图这种标准数据
- 细胞实验（略）
- 机制实验：文章做了间接作用机制，没有找到CISD2的直接调控靶分子，如果想要更高的IF，就要往PPI的方向去探索了
- 动物实验：工作量可多可少，最基本是把表型做重复，更好一点机制也要做重复，有些文章还可以有先成瘤，再打病毒的“基因治疗”验证，能够进一步提高临床的临床应用价值
- 预算情况（大概是半包的预算，细胞表型需要自己摸索和重复），总计预算10-15万，差不多是青年基金的样子，不推荐把核心实验外包，因为很少有重复
- 一个推测的时间周期：一年半文章见刊，实验是8-12个月
