文献范例：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26565812/
- 文章的科学假设：
- 文章需要建立的科学联系
- CISD2与增殖表型：正反回复验证
- CISD2与肿瘤生成：裸鼠移植瘤模型
- CISD2与Akt：机制调控方面的研究设计
- CISD2与预后+组织样本，统计分析
基础研究的四维水平
- 或者说所有的数据来源都可以归到以下四个维度上去
- 多维度相互佐证是基础研究非常重要的规律，上到CNS顶级期刊，下到IF=2-3分的灌水文章，这种数据编排的规律是一样的，数据维度可以少不可能多
细胞水平
- 一切表型的开端
- 可重复性比较好，操作性比较强
- 如果一项实验没有细胞株可以用，要用动物模型来验证表型，这种研究在先天难度上就是更加高的
- 随着分子生物学的技术发展，在细胞水平去操作一个基因变得非常容易；通过人为干预一个基因表达，或者加药/不加药，以及不同的培养诱导条件，可以创造出非常多的细胞评价模型，这有利于我们的研究
分子水平
- 也是细胞或者动物水平上去做的
- 强调通路效应，或分子相互作用这样的机制研究
- SCI文章而言，机制研究的强弱对于影响因子IF的作用是决定性的，高分文章一半都是机制的图
动物水平
- 对细胞表型和分子机制的验证，需要在动物水平进行，从in vitro到in vivo，最后再到人体标本，和人疾病的真实情况越来越接近，证据的真实情况不断上升
组织水平
- 在肿瘤研究中有非常显著的优势，病人多，样本也多；相对的，那些非致死性的疾病，很难拿到研究所需的样本，因为不符合伦理
- 肿瘤是基础研究的集大成者，表型多，模型多，分子类型多有涉及
从这篇paper的角度看
Fig.1和Fig.2
- 组织水平的结果，主要是为了说明分子高表达，在临床上是有意义的
- 潜台词和“自己往自己脸上贴金”：这个分子可能作为诊断靶标、判断预后的指标，甚至是用于治疗的分子靶点等等
Tab.1-4
- 针对临床资料的统计结果，可以与Fig.1和Fig.2归在一起
Fig.3 细胞水平表型研究数据
Fig.4 动物水平表型研究数据
Fig.5和Fig.6 机制研究数据
- 这一堆机制研究数据是文章能去到IF=5的关键
- 一堆western blot结果，检测了大量明星通路的明星分子，我们就知道作者要讲一个分子调控另外一个分子的故事了
具体的文章内容
Level 1 临床相关性
Fig.1
- 文章上来就用了TCGA数据库的内容，这么权威的样本数据库还是要知道的
- 对于肿瘤功能基因研究的文章，在文章的审稿环节，针对review环节，审稿人会问目标基因在数据库中的表达情况，那这种时候从TCGA取证就是很靠谱的来源了
- 还有一个致命的肿瘤样本数据库是oncomine（但是似乎已经停止服务了），里面也包含了TCGA的数据集
- 一个数据库合集
- 在这篇文章中，作者用到了TCGA里409例胃癌和37例癌旁组织进行比对，发现了CISD2的高表达；数据集里还发现了33例配对的样本，针对这些配对样本的癌-癌旁差异，有25例是高表达的，证据进一步加强了
- 证据找完，马上去胃癌细胞上检测，C图里有5株胃癌和1株正常胃黏膜（对照），发现肿瘤细胞中CISD2的表达是更加高的
- 作者又选了803和7901两株胃癌细胞进行后续的研究，发现两株细胞的表达量不是最高，但也不是太低；后续的研究是在同一株细胞系上，既做过表达，又做干扰，所以选中等表达丰度的细胞是合理的
- 图C是柱状图，是一个qPCR的统计分析
- 接下来的D图显然是western的结果，这两个结果去看分组是完全一样的，从中是套路规范，mRNA检测完了，再用蛋白水平做验证
- 接下来E图和F图也是同样的qPCR和western验证，这里用到了5对配对的组织样本，应该是作者自己找的，算是二次验证，进一步提高了证据的强度
- 总结了这些数据，CISD2在胃癌中特异性高表达这个结论就能总结出来了
Fig.2
- 一个免疫组化结果，是210例石蜡组织样本，这堆样本还有对应的临床资料和随访）
- A图：典型的IHC图片，展示癌比癌旁的组织表达CISD2的水平要高
- B图：体系验证，有没有这张图没啥区别
- C图：分析了不同分期的胃癌中，CISD2的表达情况，可以看到越晚期表达越高，这和预期相符，而且论证据等级，也比单纯的“癌比癌旁组织表达高”更加能证明CISD2的重要性
- D图：最关键的，生存曲线，分析高表达和低表达在总的生存OS中的差异，结果显示低表达活得更长，高表达雨后差癌基因最高的证据级别
- 经过Fig.2，CISD2的表达差异已经上升到了有临床意义的差别
Tab.1-4
- 基线资料表，单因素分析表和多因素分析包
- 这些表加上前面的表达分析结果和生存曲线图，已经可以发SCI文章了
- 这篇文章在临床相关性研究的数据呈现方面是非常规范的，三表一图（一图是生存曲线图），区别是在多因素这一步，先做了常规的病理因素分析，然后把有显著性的两个代表性结果（分期，肿瘤转移）单提取出来，再和CISD2高表达做多了一次多因素分析，把一个表变成了两个表
总结
- 新鲜组织里抽提RNA做qPCR，抽提蛋白做western，标本最好选配对的
- 用大量的石蜡组织做IHC，至少要100例以上才有说服力，有统计结果分析的差异
- 如果能在自己标本的基础上加上数据库的挖掘，那就是整套数据分析的规范动作
Level 2 细胞功能表型
- 主要在Fig.3里面
- 一个值得借鉴的设计：在A图里做了GSEA分析（参考三十六策第18策），这个为作者后期去做细胞周期相关的蛋白检测提供了有说服力的证据
- B图：验证过表达和RNAi成功的western结果
- C-F图：过表达的生长曲线和克隆形成，以及RNAi的生长曲线和克隆形成的结果，结果趋势相反，这是对的
- 克隆形成实验展示了典型图片+计数结果，都是常规的实验和常规的展示方式做所有增殖的表型都会用到这些essays
Level 3 在体功能表型
- 主要在Fig.4里面，接着用其他实验验证表型
- 只做图三和图四也能发SCI，IF会低一点，对资源也可以看作是一种浪费；但是没有办法
Level 4 通路分子机制
- 从Fig.5开始就是分子机制的内容了，但这篇文章的数据编排有点奇怪，可能是为了美观，把每张图都做的差不多大
- Fig.3是做细胞功能的，但是Fig.4中的非贴壁生长实验也是细胞功能，而Fig.4原本是动物水平的表型结果
- Fig.5主要做的是细胞周期相关的机制，但这里也有细胞表型实验BrdU，每个图的结果看上去不够聚焦，可能会给读者造成一些混淆
- Fig.5的A和B是BrdU实验，也是增殖表型的经典细胞实验，把它看成是克隆形成，生长曲线的平行验证就可以了
- 从Fig.5的C开始，就提出了CISD2影响细胞周期的观点了，细胞周期本身也是独立的表型phenotype，我们可以想到细胞周期这个表型与细胞增殖、细胞存活、细胞凋亡这些表型相关
- 机制的关键结果在Fig.6，作者在做GSEA分析的时候，发现除了和细胞周期的基因集发生了匹配，还预测到了与Akt信号通路有相关性，那么就是一样的思路了，把Akt信号通路里的明星蛋白拿出来跑个western，就可以找出CISD2的靶点了
- Fig.6的C图检测了FOXO转录因子的活性，使用的是Luciferase试验，结果有可能是后补的
- 从Western的表达变化，到转录活性，甚至是转录调控机制，在分子机制的深度上其实上了非常大的台阶，但是后面没有佐证的数据，有点让人怀疑
- 文章的优点：Fig.6里面的D-G图非常的扎实，这些图里的分组都有加入Akt通路抑制剂的”rescue组”，Fig.6的B图显示了通过上调CISD2的表达，可以提高p-Akt的表达
- 那么，当我们在过表达CISD2的体系里，加入Akt的抑制剂，阻断CISD2对p-Akt的表达上调作用，我们再去观察CISD2对增殖表型的贡献还有没有存在
总结
