公开课 转录组学

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转录组

来源：BV1qa411A7Uw

转录组简介

• 中心法则
  
  
• 转录组是特定物种、组织或细胞在特定生理状态下转录的所有RNA的集合，包括mRNA和非编码RNA（Non-coding RNA）
• 转录组测序能够快速获得mRNA表达谱；根据测定的序列同时可以对SNP、可变剪接等转录本的序列及结构信息进行精确地分析。
• 此外，通过不同的文库构建策略，转录组测序能够发现大量的ncRNA，并且对其表达水平和转录本结构进行分析；当进一步开展ncRNA与mRNA的关联分析时，就可以深入研究ncRNA的调控网络（ceRNA）

各种RNA在医学研究中被关注的顺序

• miRNA序列较短，21-24nt
• lncRNA序列较长，>200nt
• circRNA：环状RNA

ceRNA假说

• ce-competing endogenous
  
• 白色的方框——真基因；黑色的方框——假基因
  
• 具有相同miRNA应答元件，即MRE的mRNA，假基因转录物和lncRNA等转录物通过竞争性结合同种类的miRNA来调控各自的表达水平，进而影响细胞的功能

转录组在医学研究中的应用

生长发育研究

• 胚胎发育、生长发育、衰老死亡
• 通过转录组测序可以找到不同生长发育阶段、不同成长条件、不同组织器官显著差异表达、特异表达的mRNA和非编码RNA，通过进行功能注释（GO、KEGG等）和富集分析等，可以找到特异的biomarker；同时，通过将mRNA和非编码RNA进行联合分析，还可深入挖掘表型性状背后存在的复杂的分子调控机制。

药理研究

• 药物作用效果和作用机制（靶点）、新药开发
• 通过转录组测序可以研究不同类型、不同剂量浓度、不同作用时间等的药物处理对机体作用情况及其内在的作用机理。通过对显著差异表达、特异表达的mRNA和非编码RNA，通过进行功能注释（GO、KEGG等）和富集分析等，同时，通过将mRNA和非编码RNA进行联合分析，可以研究检测药物对基因表达的影响情况，从而了解药物影响机体代谢和生理病理的情况，为药理学研究奠定基础。

免疫研究

• 免疫反应、自体免疫疾病
• 通过转录组测序可以找到不同病原微生物、异物等引起的机体显著差异表达、特异表达的mRNA和非编码RNA，通过进行功能注释（GO、KEGG等）和富集分析等，可以找到关键性作用的免疫功能基因；同时，通过将mRNA和非编码RNA进行联合分析，还可深入挖掘免疫反应背后存在的复杂的分子调控机制。
• 互作转录组（用于分析免疫反应中宿主和病原菌相互反应的分子机制）
  

疾病研究

• 肿瘤、代谢性疾病、神经性疾病
• 通过转录组测序可以获得肿瘤发生发展过程中相关基因mRNA和非编码RNA的结构变异情况、表达差异情况和特异性表达情况，研究肿瘤发生和发展的分子机制，鉴定biomarker，协助疾病诊断、疾病监控和治疗以及药物靶点研究、药物开发等。
• 举例：在卵巢癌中，通过lncRNA-mRNA共表达分析鉴定与免疫相关的lncRNA生物标志物
  • 对399个卵巢癌患者取样，通过hncRNA-mRNA共表达网络分析，鉴定出两个IncRNA（RP11-284N8.3.1 andAC104699.1.1）不仅在卵巢癌发展过程中表达具有差异性，而且能预测不同发展时期病人的预后；
  • 进一步发现这两个IncRNA在IncRNA-mRNA regulatory network （OVL.MI）中位置临近，推测共同调节病人的发展阶段。
  • 功能分析发现这两个IncRNA在免疫系统的活化和抗肿瘤过程中发挥作用，子卵巢癌模型中这两个IncRNA可以作为病人病情发展阶段的评估标志物。
  • 该两个hcRNA可以作为患者的潜在生物标志物，为靶向药物开发提供理论依据。
    

外泌体

• 外泌体exosome，是细胞分泌的大小为30-100nm的微小囊泡，具有脂质双层膜结构，广泛存在于所有体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳等。
• 研究发现，外泌体包含多种活性分子，如蛋白质、脂肪和核酸（mRNA、miRNA 及其它非编码 RNA）等，能作为信号分子传递给靶細胞，从而介导细胞间的物质传递与信息交流。
• 早期这种小囊泡被认为是一种细胞废弃物，有关其研究进展缓慢。近年来，外泌体已成为科研热点，其在临床上巨大的应用价值，引起了众多研究者以及商业人士的浓厚兴趣。随着相关技术的发展，有关外泌体在临床的诊断、治疗及预后中的应用研究正在蓬勃开展。
• 目前，外泌体在癌症的诊断、治疗及预后中的应用已成为研究热点，其在生物标记物、肿瘤转移、药物载体和靶点、免疫、心脑血管、损伤修复等多个领域取得了突破性进展。
• 举例：一项以外泌体为抓手，研究缺氧与肿瘤转移相关因素的研究
  • 前期实验
    • 检测外泌体是否存在：电子显微镜+外泌体表面marker
    • 缺氧OSCC细胞外泌体影响正常细胞的侵袭和迁移：细胞划痕实验+肿瘤细胞侵袭实验
  • 外泌体miRNA测序（关注目标miRNA）
    • Rfam数据库比对
    • 样本间miRNA差异表达分析
  • 后期验证
    • 敲除实验
    • 裸鼠皮下注射实验
    • 过表达实验
    • EMT信号通路实验
  • 临床——与临床病理参数相结合

实验设计要点

根据差异设计实验

样本差异

• 样本个体组成
  • 年龄
  • 性别
  • 发育、病情阶段
  • 遗传背景
• 样本类型差异
  • 组织器官
  • （单）细胞
  • 血液
  • 外泌体

处理差异

• 处理方式差异（横向）
  • 物理（理疗）
  • 化学（药剂）
  • 生物（病原菌）
• 处理方式的内容差异（纵向）
  • 浓度、剂量梯度
  • 时间梯度

根据实验设计取样

注意事项

• 实验组的生物学重复一般建议至少5-10个，一个人即为1个重复
• 对照组的生物学重复可以稍微比实验组少一些（同病不同症状）
• 取样的注意事项
  • 随机性：避免系统误差、减少误差来源
  • 普遍性：减少个体差异
  • 一致性：非实验变量需要保持一致

取生物学重复的意义

• 减少组内个体差异的干扰，体现真实的组间差异
• 评估差异表达基因的可靠性
• 生物学重复的相关性可以辅助筛查异常的样本
• 检验生物学实验操作的可重复性
• 如不设生物学重复，部分杂志可能会因此拒稿

根据目标分子类型设计实验

取样保存注意事项

• 避免RNA的降解，以得到更好的实验效果

实验工具和环境

• 核心思路是去除内源性/外源性的RNAse
• 实验人员须穿好实验服，戴上手套和口罩，所用到的耗材和器皿以及实验区域要在RNA提取前进行RNase清除（高温干热/湿热灭酶、使用 RNA 酶抑制剂）处理
  

组织取样保存注意事项

• 所有的组织样品都要液氨速冻，-80°C保存
• （如果实验条件不允许），组织样品RNAlater 4°C过夜孵育，-20°C或-80°C长期保存
• 细胞加入裂解液反复吹打至裂解充分，液氨速冻-80°C保存

使用液氮保存组织取样注意事项

• 无酶冻存管在液氮中预先冷冻
• 活体上迅速取下组织，切成黄豆粒大小的块状
• RNAse-free配置1✖️PBS或生理盐水快速清洗组织表面的污渍，吸干表面液体后收集进冻存管，管的下部份保持在液氮中
• 液氮速冻（干冰或低温冰箱的降温速度比较缓慢，不能及时抑制RNAse的活性而引起样本讲解，因此需要在最短时间将样品转移到液氮中保存，彻底冷冻后再转移到-80°C

无液氮冷冻条件的组织取样注意事项

• 仅适用于新鲜组织样本，不适用于已经冷冻保存的组织样本，骨头，以及表面蜡质丰富的植物
• 不建议用RNA later保存液体样本，这两者会发生互溶
• 将新鲜组织切成规定的大小，按照比例加入RNA later中
• 将样本放置于4°C保存过夜，使RNA later完全渗透组织
• 转移到-20°C或-80°C长期保存
• 为避免组织块在运输的过程中露出页面，要将RNA later灌满管子

保存液相关注意事项

• 不建议寄送用裂解液保存的组织样本。除了用trizo/保存细胞的样本外，用裂解液保存的组织样本，无论是研磨好的粉未还是切割好的组织块，所抽提的RNA质量普遍较差。
• RNA later及类似保存液保存的样本，按说明将组织切小块。组织块过大会影响RNA later渗透入组织内部的效率，也会造成RNAlater无法完全覆盖组织，而未被覆盖的组织部位极易被RNase降解。

细胞样本的采集

• 建议送样细胞数>5✖️10^6

贴壁细胞的处理

• 取生长状态良好（对数生长期）细胞，确定细胞数量
• 用1X PBS洗涤细胞，离心弃PBS，洗1-2次
• 加入适量裂解液反复吹打至裂解充分
• 转移至离心管中，-80°C保存
• 按照每10cm^2（相当于六孔版1个孔或35mm直径培养皿）细胞加入1mL Trizol

悬浮细胞的处理

• 取生长状态良好的细胞悬液，确定细胞数量；
• 离心，吸除细胞培养基，1XPBS洗涤，离心弃PBS，洗1-2次
• 加入适量裂解液反复吹打至裂解充分
• 转移至离心管中，-80°C保存
• 按照每5✖️10^6个细胞加入1mL Trizol的比例

细胞样本采集时的注意事项

• 细胞必须裂解充分后再寄送，不要将冻干的细胞直接寄送
• 细胞样品胰酶消化要注意把握消化程度，胰酶会消化细胞膜上的膜蛋白，导致细胞破裂，破裂的细胞释放RNAse会导致RNA的降解
• 对于1-1000个细胞的微量样本，样本需要保存在专门的细胞裂解液中（公司寄送），标明细胞的数量（这与PCR实验循环数相关）

细菌样本采集（略）

真菌样本采集（略）

血液样品采集（略）

• 采血管用EDTA或柠檬酸钠
  
  
  

外泌体样本（略）

Total RNA样本

• Total RNA一般长期保存于-80°C冰箱，干冰寄送
• Total RNA中应当尽量避免多糖、蛋白、DNA等杂质的残留，送样时需要注明溶剂的成份
• Total RNA应当避免反复冻融，应对RNA样品小量分装
• RNA送样量
  

RNA降解的影响因素