凋亡概述
- 细胞死亡现象是细胞生物学领域最为核心的议题之一
- 细胞程序性死亡（Programmed Cell Death, PCD），是生理性的细胞死亡，强调过程的生理学特性，描述的是一个多细胞生物中，某些细胞死亡是个体发育中预订的，并且受到严格程序调控的细胞和分子生物学过程，是正常发育的一个过程和部份
- 细胞凋亡apoptosis：和坏死完全不同的死亡过程而提出的全新概念，具有特殊的生物学意义
凋亡的形态特征
- 细胞丧失表面结构，形成光滑的轮廓，从周围的正常组织中分离出来
- 细胞体积变小，胞浆内细胞器发生集中分布，细胞膜出芽或者起泡（bleb）
- 细胞发生皱缩，但是在细胞体积变小过程中，细胞胞浆内的细胞器形态始终保持完整性
- 细胞核内染色质结构改变，主要表现为染色质固缩condensation，染色质边缘化margination，细胞核内胞浆紧实compaction和细胞核核膜折叠fold
- 细胞形成凋亡小体apoptotic body，凋亡细胞裂解成很多由细胞膜包绕的小体，每一个凋亡小体内都有“一簇”细胞器，由于细胞器被细胞膜包绕，没有细胞的内容物外泄，不会引起周围的炎症反应
- 凋亡细胞/凋亡小体会被其他细胞识别和吞噬，形成吞噬体，之后吞噬体可能与溶酶体融合，形成吞噬溶酶体
凋亡的分期
- 早期（early phase），晚期（later phase）和末期（at last）
- 细胞死亡阶段（the dying process）和细胞清除阶段（the elimination process）
凋亡关键分子
Bcl-2家族
- 注意区分是分子还是家族，以免混淆
- 含有4个同源结构域，分别是BH1-4
- 根据分子内所含有的同源结构域的差异，可以分为3个不同的亚家族
细胞内Bcl-2/Bax的比例对于决定细胞凋亡的敏感性起到重要作用
Bcl-2亚家族
- 几乎都含有BH1和BH2结构域
- 对细胞凋亡起到抑制作用
- Bcl-2是细胞凋亡相关的明星分子，Bcl-2高表达时，其可以和Bax形成异源二聚体，抑制细胞的凋亡
- 主要的家族成员：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-l、Bfl-1/A1、Bcl-G等
Bax亚家族
- 都含有BH3结构域，除了这个外还含有其他的结构域
- Bax亚家族起到促进凋亡的作用
- Bax是细胞凋亡相关的明星分子，Bax高表达的时候，细胞对死亡信号敏感，促进细胞发生凋亡
- 主要的家族成员：Bax、Bak
BH3亚家族
- 只含有BH3结构域
- 作用是促进细胞发生凋亡
- 主要的家族成员：Bad、Bid、Bim、Bik、Puma、Noxa
Caspase家族
- 一组蛋白酶，介导即将发生凋亡的细胞高效且特异的蛋白分解作用，细胞凋亡中重要的效应分子
Caspase水解酶的特征
- 都是半胱氨酸水解酶
- 作用位点都在天冬氨酸Asp之后的位点
- 家族成员都是以酶原的形式存在的，需要经过活化
Caspase按照功能分别的亚类/组
- 凋亡启动亚类apoptotic initiation：Caspase-2, -8, -9, -10，在细胞凋亡的起始过程中发挥重要作用
- 凋亡效应亚类apoptotic execution：Caspase-3, -6, -7，具体执行细胞凋亡的效应分子，在信号传导中始终处于凋亡启动亚类Caspase的下游
- 细胞因子激活类cytokine activation：Caspase-1, -4, -5, -13，和细胞凋亡的关系不是很密切，可能和多种炎症因子和细胞因子的成熟有关
介导凋亡的信号通路
线粒体通路
- 脊椎动物的细胞凋亡调控中，线粒体被认为处于中心位置
- 死亡信号激活含有BH3结构域的Bcl-2结构成员，比如bax，这些成员发生寡聚化，并且插入线粒体膜，引起线粒体膜跨膜电位丢失，释放线粒体内的细胞色素C（CytC），以及其他的蛋白
- CytC的释放是线粒体凋亡途径的关键限速步骤：CytC与凋亡蛋白酶激活因子apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1形成多聚复合体，通过Apaf-1 N-terminus的Caspase募集结构域，也就是CARD来募集细胞质中的Caspase-9前体，并使其自我剪切活化，最终启动下游的级联反应，激活Caspase-3和-7
- 线粒体是细胞能量代谢的中心，细胞凋亡中，对线粒体损伤最直接的影响是线粒体正常功能的丧失，而线粒体功能障碍除了会诱导细胞凋亡以外，还会导致自由基产生增加，兴奋性氨基酸释放过多，Ca++超载等现象
- 如果细胞的损伤程度相对较轻，ATP能提供细胞凋亡所需要的能量，细胞就会发生凋亡；如果细胞损伤的程度很重，ATP急剧耗竭，那么细胞发生的就是坏死现象了
内质网通路
- 细胞内蛋白质合成的主要场所，也是Ca++的主要储存库，内质网在维持细胞Ca++水平的稳定，和膜蛋白的合成、修饰和折叠方面都发挥了关键性的作用
- 除了在蛋白合成过程中的作用以外，内质网还参与凋亡信号的处理和传递，内质网参与的凋亡通路和其他两者（线粒体和死亡受体）有很大的不同
- 内质网内Ca++平衡被破坏，或者内质网内蛋白的过度积累，都会诱导Caspase-12在内质网膜上的表达，同时，内质网也介导了细胞质的Caspase-7转移到内质网表面，并且激活Caspase-12；激活的Caspase-12可以激活Caspase-3，引发细胞的凋亡
- 内质网功能的失调，在某种程度上会影响线粒体通路的凋亡现象：许多细胞在凋亡早期，由于内质网内Ca++会导致胞质内迅速且持续的升高，高浓度的Ca++可以激活细胞质中的Ca++依赖型蛋白酶，后者作用于线粒体，引起线粒体通透性和膜电位的改变，从而促进凋亡
死亡受体通路
- 细胞外的死亡信号可以通过死亡受体传入细胞内
- 死亡受体是一类跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体TNFR超家族，胞外部份普遍含有一富含半胱氨酸的区域，胞质区有一同源氨基酸构成的结构，这个结构具有蛋白水解功能，被称为死亡结构域（Death Domain,DD）
- 死亡结构域使死亡信号得以进一步传递，最终启动凋亡
已知的死亡受体
- TNFR1，也被称为p55/CD120a/DR1
- Fas，也被称为Apo-1/CD95/TNFRSF6
- DR3，也被称为Apo-3
- DR4，也被称为TRAILR1
- DR5，也被称为Apo-2/TRAILR2
已知的死亡配体
- TNF，肿瘤坏死因子，与TNFR1对应
- FasL/CD95L，与Fas对应
- DR3L，与DR3对应
- Apo-2L/TRAIL与DR4以及DR5对应
Fas/FasL通路
- 这俩也被称为CD95/CD95L
- Fas通路在免疫系统的发育中起到重要的作用，很多细胞都表达Fas，但FasL只在激活的T细胞和NK细胞中表达
- FasL是一个同源三聚体，每一个FasL结合三个Fas；一旦与三聚体FasL结合，Fas的胞内段death domain就会招募细胞内含有DD的死亡相关蛋白Fas associated protein with death domain，FADD
- FADD氨基端含有一“死亡效应”结构域（Death Effect Domain,DED），DED可以与Caspase-8的DED相互作用，引起Caspase-8的募集，从而形成Fas-FasL-Caspase-8的“死亡诱导复合体（Death Inducing Signal Complecx,DISC），Caspase-8酶原被激活，并自我剪切活化，形成有活性的Caspase-8，Caspase-8再去激活下游的Caspase-3,-6,-7，
- Caspase-3,-6,-7可以剪切下列底物：PARP,DNAPK，PKCO，iCAD，iCAD可以被剪切为CAD转运入核，降解染色质DNA
TNF/TNFR通路
- TNF主要在激活的巨噬细胞，淋巴细胞中发挥作用，TNFR1在各种组织中都有表达
- TNF通过下游的TNFR-1和TNFR-2介导下游的生物学活性，这俩在胞外结构域具有同源性，但TNFR1的胞内段有DD，TNFR2是没有的；即便如此，这两个受体都可以介导凋亡
- 研究发现，TNFR不具有酶解活性，TNFR是通过招募其他分子的方式，来传导细胞死亡信号的
- 当TNF结合TNFR后，后者发生三聚体化，然后招募一衔接蛋白TRADD，TRADD再招募其他的3个衔接分子，其中包括FADD，TRAF2和RIP
- 如果TRADD和RIP、TRAF2相互结合，那么下游激活的是NF-κB信号通路，或者是JNK-AP1通路
- 如果TRADD和FADD相互结合，那么下游就会招募和活化Caspase，并激活凋亡相关的信号通路
DR3信号通路
- 主要在脾脏、胸腺和激活的T淋巴细胞中表达
- DR3的氨基酸序列和TNFR高度同源
- DR3信号通路和TNF/TNFR通路也是基本一致的，也可以激活下游的NF-κB信号通路，以及Caspase介导的细胞凋亡
TRAIL信号通路
- 配体是TRAIL，又被称为Apo2L，可以结合DR4也可以结合DR5
- DR4和DR5的氨基酸序列与TNFR高度同源，TRAIL信号通路和TNF/TNFR通路也是基本一致的，也可以激活下游的NF-κB信号通路，以及Caspase介导的细胞凋亡
凋亡的检测方法
形态学检测
- 通过显微镜，观察细胞甚至亚细胞层面的变化以及形态学特征
- 光学显微镜-细胞缩小，核浓缩，核周出现透明圈的现象
- 相差显微镜-细胞鼓泡，凋亡小体的产生
- 透射电镜-细胞表面微绒毛的消失，核染色质沿核膜分布，新月体形成以及凋亡小体形成等
流式细胞仪检测
- 也就是通常所说的Annexin-Ⅴ-PI双染色实验
- 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸PS只分布在细胞的脂质双分子层的内侧，细胞发生的早期阶段，PS外翻，从内侧移动到外侧，Annexin-Ⅴ是一种磷脂结合蛋白，和PS有高度亲和性，通过结合细胞外侧暴露的PS-结合细胞膜上，检测细胞的早期凋亡水平
- PI-细胞核染料，不能透过完整的细胞膜，在凋亡的晚期阶段，或细胞发生坏死现象时，由于细胞膜的完整性已经被破坏，PI能透过细胞膜，与细胞发生结合
- 流式细胞仪把细胞分为四种
- 两种都阴性：正常活细胞
- Annexin-Ⅴ（+），PI（-）：早期凋亡细胞
- 两种都阳性：晚期凋亡或者坏死的细胞
- Annexin-Ⅴ（-），PI（+）：非特异性染色所导致的
核酸电泳检测/DNA片段检测法
- 细胞发生凋亡时，细胞中DNA发生断裂，小分子的DNA片段不断增加，高分子的DNA不断减少，而且在细胞的胞浆内出现DNA片段
- 凋亡细胞的DNA断裂是有规律的，由于内源性核酸内切酶的作用，DNA的断点主要发生在核小体之间，断裂的DNA都是180-200bp，或者180-200整数倍的DNA片段
- 在凝胶电泳中，如果看到了这种特征性的DNA片段，就可以认为有细胞发生了凋亡
检测凋亡明星分子
- western检测蛋白
线粒体通路
- 激活的Caspase-9和Caspase-3（要看清楚抗体的说明书，识别的是前体Caspase，也写作pro-Caspase，还是激活后的Caspase，还是两者都可以）
- 最常检测的Caspase-3的底物是PARP
Bcl-2家族
- 通过western检测Bcl-2和Bax分子，根据这俩的比值来表征细胞的凋亡程度
死亡受体介导的凋亡通路
- Fas/FasL
- TNF/TNFR（下游的分子个性化选择，没有一定的标准）
- FADD