细胞周期概述
- 细胞周期，cell cycle，指的是细胞从一次分裂完成开始，到下一次分裂结束的全过程；细胞在细胞周期的各个时相中进入增殖、分化和衰老、死亡等生理状态
细胞周期的时相
按照细胞周期的时相进行分类
- 体外研究发现，大多数细胞的细胞周期是10-48个小时，一般可以分为4个或5个时相
- G1期：DNA合成前期（关键步骤），细胞周期长短主要由这个时期所决定
- S期：DNA合成期
- G2期：DNA合成后期
- M期：有丝分裂期，M期一结束，两个子代细胞就形成了，这也标志着这一轮的细胞周期结束
- G0期：某些细胞或者某个阶段的细胞可以从G1期退出细胞周期，但是细胞仍然存活；这些细胞受到某种刺激后仍然能够进入细胞周期，进行DNA复制和有丝分裂
按照染色体的倍数进行分类
- 在G0期和G1期，细胞处于DNA合成的前期，此时细胞内的DNA没有复制，染色体是2n
- 细胞进入S期，细胞中DNA开始复制，S期开始时是2n，结束时是4n，即染色体数量在2n-4n之间
- 细胞进入G2期和M期，细胞内染色体的数量维持在4n
细胞周期检查点checkpoint
G1/S期检查点
G2/M期检查点
- 决定细胞是否一分为二，形成两个子代细胞
- 通过了这个检查点，有丝分裂才开始进行
参与细胞周期调控的关键分子
- 检测明星通路的明星分子
- cyclin/CDK/CKI的信号调控网络，能够精细地调控细胞周期的全过程
细胞周期相关的信号通路
- 首先生长因子与细胞表面的受体结合，刺激细胞由G0期进入细胞周期，同时启动fos/jun/myc等immediate early gene表达，在这些基因的刺激下，细胞开始激活CDK和G1期的cyclin等分子
- CDK和cyclin组装成有激酶活性的复合物，cyclin-CDK复合物可以磷酸靶蛋白pRb，磷酸化的pRb不能与转录因子E2F结合，游离的E2F进入细胞核内，调控一系列与DNA合成有关的基因的转录，促进DNA合成，推动细胞周期的进展
- 磷酸化pRb-E2F是经典的G1/S期调控途径
细胞周期的内源性调控
- 参与细胞周期的内源性调控分子是cyclin和CDK，其中cyclin对于CDK有正向促进作用，且cyclin蛋白的周期性积累与降解对细胞周期进程起到了关键性的作用
- CKI这个分子是对CDK起到负向作用，CKI能够与单独的cyclin或CDK，或者cyclin-CDK复合物结合，抑制他们的催化活性
- cyclin和CKI分别对CDK进行正向和负向调控，一旦这种调控平衡被打破，细胞就可能异常增殖
- cyclin的种类越来越多了，cyclin a-h 8类，其中cyclin d有1-3共3种，cyclin b有1-2共2种，所以cyclin共有11种亚类
- cyclin亚类随着细胞周期时相的变化而变化，在不同的周期/时相内表达，或者达到含量和活性的峰值；CDK在整个细胞周期中表达量相对恒定，所以在整个细胞周期中，有明显周期性表达的cyclin和表达相对稳定的，不同的CDK相互结合，形成复合物，从而激活CDK的激酶活性，达到在不同时相精准调控细胞周期的功能
cyclin对细胞周期的调控主要表现在G1期、S期和M期
G1期cyclin-CDK在G1期和G1/S交界处都发挥作用
- cyclin D1/D2/D3/E/C
- cyclin D1在G1早期表达，是细胞周期的启动因子，也是生长因子的感受器；cyclin D1过表达可以加速细胞从G1期到S期的转换，使细胞快速通过G1-S检查点，S期缩短；阻断或是敲除cyclin D1可以导致细胞周期阻滞，诱导细胞的凋亡
- cyclin D可以与CDK 4/6结合，形成复合物，cyclin D具体集合哪一种往往由细胞的种类决定
- cyclin D与CDK 4/6结合后，可以使CDK 4/6 的172位酪氨酸残基磷酸化，激活CDK的激酶活性
- cyclin E的合成开始于G1中期，表达水平最高的时候是细胞进入S期，同时cyclin E的降解也发生在S期；cyclin E在G2/M期不表达
- cycin E主要在G1晚期发挥重要作用，是G1/S期转化的限速因子，在G1和S期，cyclin E与CDK 2形成复合物，能使pRb因为磷酸化的失活，转录因子E2F入细胞核，使细胞进入S期
S期cyclin-CDK发挥的作用
- cyclin A，在G1晚期开始增多，在S和G2期达到表达上的峰值，可以检测出激酶活性
- cyclin A表达受到抑制，细胞周期会停滞在S期
- 当细胞进入S期后，由于cyclin E的表达水平迅速降低，从而使G1期的cyclin E- CDK 2 复合物解体，游离的CDK 2还能与cyclin A结合
- 有报道称cyclin A 可以与CDK 1结合，并且在G2期达到活性峰值
- 传统观点还是倾向于认为cyclin A与CDK 2结合，介导细胞通过S期
M期cyclin-CDK发挥的作用
- 发挥重要作用的是cyclin B
- cyclin B在G1晚期开始合成，在S期表达升高，在G2晚期和M期达到峰值，并且进入细胞核内，与CDK1结合，激活其激酶活性，复合物可以引导细胞进入有丝分裂的M期
- 当细胞退出M期，cyclin B降解，CDK 1磷酸化活性丧失，底物去磷酸化，促进染色提的凝固和核膜、核仁重建，细胞进入下一个细胞周期
CKI的结构和功能
Inhibitor of CDK4, Ink4
- 特异性抑制cyclin D-CDK 4的激酶活性
- 已知的Ink4有p15、p16、p18、p19，上述基因有很多名称，比如p16还可以写成p16^Ink 4a、p16^MTS1，而且这些名字在文章中都很常见，没有一个明确的、最popular的名字
- 这些名字是不能混淆的，比如p14和p16是完全不同的两种蛋白，发挥不同的功能，但是编码这俩蛋白的基因都位于染色体的9p21的位置，有相同的外显子2和外显子3，但是外显子1不同（p14-外显子1β/p16-外显子1ɑ），p14和p16的蛋白序列是不一样的
- p16属于CKI，参与p16-cyclin D-CDK4-pRb的信号传递；p14参与p14-MDM2-p53信号通路调控，通过解除MDM2对p53蛋白的抑制，最终启动细胞周期的阻滞或凋亡
- Ink4蛋白的结构和功能都有一定的相似性，以p16-Ink4a为例，它有3个外显子，2个内含子，cDNA全长960bp，编码蛋白16kD；Ink4蛋白的N-terminal含有4个钩状重叠组成的二级结构，和cyclin D1的序列有很高的同源性，因此Ink4能够和cyclin D1竞争性结合CDK 4/6，抑制pRb的磷酸化作用
- Ink4的突变可以导致细胞周期发生紊乱，目前已经在多种肿瘤，包括胰腺癌、NSCLC，神经胶质瘤，急性白血病中发现了p16-Ink4a基因缺失的现象
Kinase inhibition protein, Kip
- 非特异性抑制绝大多数CDK的活性
- 已知的KIP包括 p21cip1 （cyclin inhibition protein 1）、p27kip1（kinase inhibition protein 1）及p57kip2三种，在N-terminal有结构和功能上的相似性，都含有保守的80个AAs的序列，能抑制cyclinD1-CDK4复合物，或者是cyclinD1-CDK6，cyclinE- CDK2，cyclinA-CDK2
- 这三个分子（p21、p27、p57）在C-terminus的功能是各不相同的，p27的C-terminus有一苏氨酸磷酸化位点，可以抑制H1组蛋白的磷酸化；p21的C-terminus有一40AAs的肽段，可以与PCNA结合，抑制PCNA与DNA-pol的结合，影响DNA的复制
- p21和p27在绝大多数哺乳细胞中都有广泛的表达，可以通过表达量的变化调节细胞周期和细胞分化，p57只在部分组织中有表达，使细胞周期停滞于G1期，但是从研究的范围和广度不及前两者
细胞周期调控途径和机制
pRb为主的调控网络
p53为主的调控网络
- 哺乳动物在受到DNA损伤后，细胞周期的进程会停留在停滞在两个检查点
- 抑癌基因p53主要在G1/S检查点上发挥作用
- p53可以作为转录因子，诱导下游蛋白的产生，从而达到调控细胞周期的作用
机制一：p53诱导p21的表达
- p21基因的启动子区域有p53的结合位点，促进p21基因的转录
- p21能够抑制CDK的活性，尤其是cyclinD-CDK4的活性，使细胞停留在G1期，从而使细胞进行DNA修复；如果损伤过于严重，会激活细胞凋亡
- 注意，因为p21作为CKI参与抑制cyclin-CDK复合物的功能，所以可以说p53通路和pRb通路存在cross-talk
机制2：p53诱导GADD45合成
- GADD45可以结合PCNA，抑制DNA合成，抑制细胞自己进入S期
机制3：p53诱导Bax
- Bax是凋亡相关基因，可以和Bcl-2相互作用，共同调节细胞的凋亡
细胞周期相关的实验检测
检测明星分子
- cyclin
- CDK
- 磷酸化的pRb
- 磷酸化的p53
PI染色实验
- PI的全程：碘化丙啶，插入性核酸染料，选择性嵌入DNA的双链之间并且发出荧光
- PI结合的量与DNA的量成正比，用流式细胞仪分析就可以得到细胞所处的不同周期的状态，从而得到对应的含量
- 模式图：
* 横坐标-DNA含量；纵坐标-细胞数量
* 有些时候，在进行PI染色实验并通过流式细胞仪检测后，会在左侧第一个峰的左侧还有一片区域，这片区域被称为 sub-G1 期(在模式图中，没有标注sub-G1期)， 一般认为 sub-G1 期的细胞都是发生凋亡的细胞，和细胞周期没有关系
- 在细胞周期的整个时相内，G0和G1期发生在DNA复制之前，此时细胞内染色体的数目是2n
- 在S期，DNA发生复制，染色体数量在2n-4n
- 在G2期，DNA复制已经完成，细胞内染色体的数量是4n
