- 三十六策是用来建立对科研的总体宏观认知，或者说科研的总论
- 二十四型是用来树梳理表型和研究方法的认知，相当于一本手册
- 增殖是生物医学领域一种非常常见的表型，或者说是最常见的表型
- 体细胞增殖（有丝分裂）
- 性生殖细胞增殖（减数分裂）
- 增殖表型如何检测
- 研究层次可以大致理解为研究样本的来源
- 研究层次之间是相互包容的关系，不存在相互排斥（宏观包涵微观中的研究内容）
分子层面
免疫组化：检测增殖相关的分子标志物
PCNA（直接相关）
- 又被称为周期素，是DNA-pol delta的辅助蛋白
- 经典的增殖相关的分子标志物
- 出现在增殖细胞的细胞核中
- 参与DNA损伤的修复和细胞周期的调控
- 和p21相互作用，间接影响细胞周期
- G0和G1期几乎没有表达，G1晚期表达大幅度增大，S期达到高峰，G2/M期表达下降
- 用于临床病理诊断和相关的基础研究中
- 缺陷：
- 在G1期早期不表达，和细胞周期存在时间上的错位性
- 在DNA修复和复制中也会表达，可能导致结果出现假阳性
细胞核相关抗原Ki-67（直接相关）
- 在病理诊断中广泛使用
- 可能具有如下功能
- 调节细胞周期
- 和DNA/RNA相互结合
- 在细胞分裂期参与合成核糖体
- 在G0期不表达，G1的中期和后期开始表达，S期和G2表达逐渐增，M期达到高峰
- 分裂后迅速降解
- 缺陷：
- 同PCNA，在G1期早期不表达，和细胞周期存在时间上的错位性
- 表达水平收到外界因素的印象，比如营养缺乏
微小染色体维持蛋白MCM（直接相关）
- mini-chromosome maintainance protein
- 只存在于真核细胞中，在有丝分裂的晚期和G1期与染色体紧密结合，在G2期和S期与染色体分开
- 只在细胞增殖期能检测到
- 表达在G1/S期转换点达到峰值，分化期和静息期缺失
- 相对比较新的增殖指标
- 整个细胞周期都有MCM的表达
- 不受到DNA修复和复制的影响
CD44（间接相关）
- 胰腺癌肿瘤干细胞常用的分子标志物
- 间接证实肿瘤细胞增殖能力的强弱
- 不同肿瘤的肿瘤干细胞分子标志物不一样，在很多肿瘤中甚至没有一个达成广泛共识的肿瘤干细胞分子标志物
- 证明的力度不如检测直接相关的3个蛋白，只能算锦上添花
p53和PTEN（间接相关）
- 抑癌基因
- 用western或qPCR证明分子表达水平降低，间接说明肿瘤恶性程度上升
- 起到锦上添花的作用
- 在细胞内，抑癌基因的表达水平或活性下降，说明肿瘤的恶性程度上升，恶性增殖表型当然也会有所增加
细胞层面
MTT比色法
- 活细胞的线粒体中琥珀酸脱氢酶可以把外源性MTT还原为水不溶性的MTT紫蓝色结晶甲臜Formazan并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
- DMSO能够溶解细胞当中的甲臜Formazan，最终用酶标仪在特定的波长处检测光的吸收值，就间接反应细胞增殖的情况了
- 经典方法
- 取5个时间点，通常是5天，把5天中每一天的吸光度都记录下来，最后形成一条细胞增殖曲线
- 通过比较不同处理法/不同分子的细胞的增殖曲线，可以比较它们的增殖快慢
- 优点：简单，便宜，易于复制
Brdu染色实验
- Brdu是胸腺嘧啶的衍生物，可以标记活细胞中新合成的DNA
- 代替胸腺嘧啶，选择性整合到新合成的DNA中
- 渗入可以稳定存在，随着DNA的复制，Brdu可以进入子代细胞
- Brdu特异性抗体可以用来检测Brdu在细胞中的渗入情况，从而判断细胞增殖能力的变化
- 使用单克隆抗体后，使用免疫荧光来显色；同时结合其他细胞标记物，进行双重染色，可以判断增殖细胞的种类和增殖速度，对细胞动力学有意义
- 没有内源性Brdu的存在，所以这种方法对于检测细胞的增殖非常的广泛
- 通过Brdu染色法，可以提供影像学相关的数据，比MTT比色法只能提供单纯的折线图，可以提供更有视觉效果的图片
Edu染色法
- 原理基本同Brdu
- 检测时候用荧光染料就可以了
- 更有效检测细胞增殖的现象
实时细胞分析法RTCA
- 需要用到特定的细胞培养法，称E-plate
- E-plate底部有电极，作用是实时记录孔皿内的电阻抗
- 细胞在孔内发生粘附、转移、增殖的时候，孔内的电阻抗发生改变，被研究者实时记录，也就获得了相应的数据
- 不仅可以用于细胞增殖数据的获取，也可以用于检测细胞的粘附、凋亡、转移等现象
- 相比MTT只能记录少数几个点数据，RTCA法有更多的优势
- 获得更多数据
- 获得整个培养周期内，细胞增殖动力学的变化过程
- 缺点：贵
- 能用更好，不能用也不用沮丧，学术界检测增殖的经典方法还是MTT
克隆形成实验
- 只适用于肿瘤细胞的特殊增殖能力
- 正常细胞在增殖的时候，需要细胞与细胞之间的信号传递，这些信号的存在可以使细胞的增殖过程受到各种有序的调控
- 肿瘤细胞具有高度恶性，其增殖是不受调控的，即使是缺少细胞之间的接触和信号传递，肿瘤也可以从单个细胞增殖成一堆子代细胞，最终形成一个子代克隆，最终加以检测
- 在空板内加入极低密度的肿瘤细胞悬液，让肿瘤细胞和细胞间的间隔非常远，近似认为肿瘤细胞间没有关联，经过一段时间后，再检测有50个细胞以上的细胞克隆
- 通过克隆形成实验，可以用来评估肿瘤离体增殖能力的大小和肿瘤体外滞留能力的大小
- 对于干细胞也有类似的实验，用来检测干细胞的增殖能力，称悬浮成球实验
组织层面
- 肿瘤科室具有丰富的样本资源
- 基于组织样本的研究会成为非常广泛且有效的手段
石蜡切片
- 免疫组化，检测和增殖相关的分子标志物（PCNA，Ki-67和MCM）
- 通过石蜡切片获取比较高质量的DNA或micro-RNA样本，也可能获得比较低质量的mRNA或蛋白样本
- 要注意区分肿瘤区域和癌旁区域
新鲜组织样本
- 存放于液氮，或者-80°C冰鲜的味道
- 如果保存得当，是可以获得蛋白，mRNA，甚至lncRNA的
- 可以用于后续的western和qPCR
- 在取样的时候要注意区分癌组织和癌旁组织
形态学
- 检测癌细胞和正常组织在形态学上的巨大差异
- 恶性肿瘤细胞一般比正常细胞大，即便是同一种肿瘤，在相同的组织部位，肿瘤细胞的大小和形态也会非常地不一致，有时甚至会出现巨细胞
- 细胞核：核/浆比例增大，巨核，双核，多核，奇异核细胞
- 在组织内发生肿瘤后，由于肿瘤细胞不受控制地恶性增殖，而且挤压了周围的正常细胞，会导致正常组织内的，细胞有序的排列顺序遭到破坏
- 通过对组织内部细胞排列顺序和结构的检测，也能获得肿瘤细胞发生恶性增殖的证据
动物层面
移植瘤动物模型
- 记录移植瘤的大小/体积，肿瘤的重量
- 以移植瘤样本作为对象，检测细胞行为学，形态学，分子标志物等
- 增殖相关的分子标志物
- 把移植瘤样本抽提，形成匀浆，然后检测蛋白（wb）或者RNA（rt-PCR）
- 对移植瘤组织切片，然后免疫组化
- 细胞的组织形态：移植瘤的中心部分细胞密度过高，无法接触到充足的氧气和养分，移植瘤中心部分形成部分组织的坏死
- 恶性程度越高，坏死的程度就更加明显
总结
- 无论是动物层面的研究，还是组织层面的研究，最终都要通过降低维度的方式，回到组织和细胞层面进行相关的检测
- 在做基础研究和表型相关的研究，分子和细胞层面是所有研究的基础
