- 通路不作为单独的变量因素
- 药物作为变量的套路比分子更简单，所以我们掌握了分子就不愁药物了
- 分子这个变量之所以复杂，一个主要的原因是它的数量很大（浩如烟海），而且分子本身会发生各种修饰变化
- 两万多个基因编码十万多种蛋白质
- 非编码RNA的数量比编码的基因数量大很多，到底有多少没人知道
- 老师，我该怎么找SCI分子呢（最好能尽快发SCI的hhh）——要么筛，要么猜；有钱筛，没钱猜
- 科研界的大户人家在发高分SCI时的常见套路：提出一个原创问题-筛选有相应特征的组织样本-高通量筛选，提供独家经营的稀缺感，创新的小火苗熠熠生辉，连绵不绝，但高通量筛选是非常贵的项目，大概是30-40w
关于分子筛选的那些事
- 复习Lesson 3的内容，医学基础科研由组学、分子、细胞、动物四个实验体系，其中的组学，又可以进一步细分为基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学，就是用来筛选分子的方法
- 从DNA水平和RNA水平筛选分子，常用的方法是基因芯片和测序
- 检测mRNA的芯片一般叫表达谱芯片
- 检测microRNA的叫microRNA芯片，检测lncRNA的叫lncRNA芯片
- 其实检测原理都是一样的，只是名字不同，可以归类在一类里面
- 用在高通量筛选里的测序，一般特指二代测序，也叫NGS，可以用来区分编码的mRNA和非编码的microRNA
- 一次全转录组测序，可以获得mRNA，microRNA，lncRNA，甚至是circRNA的全面信息，这在当下研究中是流行的趋势
- 从蛋白水平和代谢组学筛选分子，主要会用质谱
芯片、测序和质谱三大平台
基因芯片
- 基因芯片，也叫生物芯片，是国内比较早进入科研界的生物学技术，而且产业化程度相对成熟
- 两大中心（博奥芯片和Shanghai Biochip，SBC）
- 基因检测的基本原理是杂交
- 已知序列的核酸探针与样品的DNA或RNA进行杂交，碱基互补配对配上了就能释放荧光信号的检测方法
- 在人类基因组计划把人类的所有基因都测出来以后，我们可以针对性地设计很多探针，去特异性检测某个目的基因，每个探针针对一个靶基因序列
- 把这堆探针固定在一个Chip上，然后投入样本，就可以在短时间内检测大量的sample；而且，在实际操作中，为了避免漏检，一个基因会设计多个探针来检测，所以芯片也叫微阵列Microarray
- NGS听上去很简单，但实际上操作有非常多的细节；作为医生做科研，我们不需要知道这些细节，只要知道怎么制备样品和分组，怎么把样品送到公司检测，付钱和等着收报告就可以了
- 芯片检测核酸是比较常规的应用，但是也有抗体芯片这样的东西，用于检测蛋白，也叫蛋白芯片
- 蛋白芯片的应用场景会比基因芯片少一些，毕竟直接筛选的课题的程度比较少，倒是在分子已经做出了表型，要往下游去筛选调控的信号通路，形成分子+通路的二源结构课题时，用来分析通路变化的蛋白芯片会更加常见一些（见后）
测序
- 我们所说的测序，一般是二代测序NGS，有时也叫deep-sequencing
- 芯片能干的活，NGS基本都能干，而且表现会更加得出色
- 一代测序用在构建质粒完成的时候，也叫Sanger测序，一个反应20块，能读大概800个bp
- 做DNA和RNA的二代测序，测的都是DNA，也就是测RNA的时候会多一步用逆转录酶去合成cDNA，然后把样本打成几百个bp的小片段（建库），建完库以后两端加上接头（barcode），之后用带有不同荧光染料的4种核苷酸去进行PCR，通过捕捉荧光染料来测序
- 三代测序技术：在NGS之后，称为TGS（Third Generation Sequencing）或者单分子测序（Single Molecule Sequencing,SMS），反应速度特别快，而且一次反应能测非常长的序列，而且准确率高，唯一的特点就是贵
- 四代测序技术：纳米孔测序，把原来捕捉光信号变成了电信号，其他是不变的
- 版本1：如果想省钱，简单的表达谱分析用芯片做就好了，做non-coding RNA这种就可以用芯片，因为能够发现潜在的新序列
- 版本2：检测mRNA表达谱的报价，要比芯片还便宜不少，在未来可能用芯片来筛选DNA和RNA就可以了，基因芯片用来小分子群（分子panel）来检测，因为可以批量制备一堆芯片，做固定的、分子群的、大样本的检测
质谱
要从蛋白水平筛选分子的常规套路
- 把蛋白分离开
- 二维电泳：等电点+分子量（没有任何两个蛋白是有相同的分子量和等电点的，前者由序列决定，后者由空间结构决定）
- 通过跑胶，可以把混合样品中的单个蛋白分离出来
- 如果有两组样品，跑完胶之后比较一下有差异的点，就可以得到有差异筛选的结果，这个差异蛋白具体是哪个蛋白，需要把胶里的蛋白切出来，然后去质谱分析
- 对蛋白进行鉴定：质谱
- 质谱是利用电场和磁场，将样品产生的带电粒子按照质/荷比进行分离的机器，相当于鉴定蛋白质的指纹
- 不仅筛选分子的时候鉴定蛋白质需要指纹，以后做到分子机制，蛋白-蛋白互作，RNA-蛋白互作都要质谱，当然先得把蛋白质拉下来
- 质谱分析一般都是外包，自己做不了的
DNA、RNA和蛋白具体从哪个角度筛比较好
- “我都筛”——没那么多钱
- 研究经费允许：8-10w+，找一下有价值的分子靶标——NGS去查非编码RNA，检查lncRNA和circRNA，表型和疾病根据既往的研究经历不要动，直接进入热点分子的研究领域
- 科研是有热点倾向的，这些热点是科学家创造的，但追逐热点是医生做科研重要热点
- 预算不是很多，能拿出3-5w去筛一筛：有自己的筛选结果比纯粹猜要好很多，因为有自己独一份的数据结果，再对比着其他的文献、数据库来综合评估；预算相对不多，玩不起NGS的，筛筛表达谱分析也不错（注意不要选DNA而是mRNA）
- DNA离蛋白的功能隔了一个环节，不是很直观
- 大部份疾病中DNA没有发生改变，而是表观遗传水平发生了改变，这种情况下筛DNA什么都筛不出来
- 蛋白是功能的执行者，蛋白不是很稳定，有观察的时间窗口（半衰期），而且有些差异很细微，不是很好观察到；蛋白筛选，样品处理也很关键，所以常规来说还是从转录水平入手比较好
- 在验证表达差异的时候，做mRNA水平的验证上qPCR，比起订抗体做wb验证蛋白的差异要省钱太多了
