- 在上一节课中，我们初步介绍了二元细胞嵌套的逻辑，细胞交互的模式相当于在细胞表型和分子机制中间，在逻辑上又加了一道夹层，提供了一种崭新的维度——我们需要考量变量发挥作用的空间，从一个细胞空间来的变量分子在另一个细胞空间里发挥了功能，某种意义上讲的是一场外星人入侵地球的故事。
- 变量不仅有主次，要分上下游，还要区别是在供体还是受体细胞中执行调控关系，由此构成了文章逻辑层次的最后一层。变量代入恒量是逻辑第一层，多元变量组合是逻辑的第二层，分子交互的直接作用模式是逻辑第三层，细胞交互造成的空间转换是逻辑第四层，可以说在下图的十二宫中，就已经涵盖基础科研中全部的模块化逻辑规则。理解完全之后，三十六策方法论的骨架就算修炼成了。单变量、多元变量间接调控、分子直接交互和细胞交互四层逻辑，也是一个医学科研领军人物的必备素养。
- 细胞交互是一种万能的研究框架，但是涉及到一系列的具体学科领域，我没有办法逐一拆解，我们学习的重点还是要结合自己的问题开展应用，针对自己的研究方向进行知识的拓展。三十六策的内容主要是方法论，方法是宏观的，具体研究工作是微观的，宏观到微观的联接需要自己动脑筋。自己的方向上有哪些细胞的交互通讯能够被研究，这是一个值得挖掘的命题。在上一讲也说到了，掌握了二元细胞结构，文章的影响因子起点就是5以上了，低影响因子的文章根本没必要做复杂的多细胞体系。目标起得高，也要为之付出更多投入，我取法其上得其中，立志突破IF=5这个档次的话，细胞交互就是值得实践的豪华科研套路。文献泛读的技巧要好好领会，学会了泛读筛选文献，速度就很快，模式套的上的典型文献依靠泛读就能找出来，然后自己去精读，总结实验设计，还有模型-实验方法-分子标志的常识。
细胞交互中涉及到的分子类型
- 我们前面梳理过分子这个变量，分子可以分为编码基因的蛋白和非编码RNA两大类
- 蛋白的表达改变要考虑DNA、RNA和蛋白以及转录后和翻译后修饰，一共是5个水平的调控环节。
- 非编码RNA的类型有很多，我们主要关注miRNA、lncRNA和circRNA，这三类非编码RNA分子是当前医学研究中常见的分子变量担当。
- 这些之前讨论过的分子类型，都是可以承担细胞间传递信息的重任的。这节课我们会提到一些新的分子类型，是进入到细胞交互层面的研究才会涉及到的，这些分子主要的角色就是在细胞外进行信号的cross-talk，有时候细胞已经凋谢，但是它的分子信号却可以传递下去，我把它称之为“薪尽火传”，也就是这一策的名字，属于逻辑第四层特有的套路模式。
- 几乎所有的体液中都会有信号分子的存在，特别是在血液中存在的这一类对于疾病的诊断、治疗效果的评价、预后的追踪等都有深刻的转化意义，值得我们投入十二分的关心。我们有一个单独的名称来描述这一类分子，叫循环分子，英文术语是circulating。circulating后跟分子类型，比如circulating miRNA就是循环miRNA，circulating lncRNA就是循环lncRNA。
Circulating蛋白/细胞因子
- 蛋白是执行生物功能的基本单位，用来传递细胞交互信号的circulating蛋白自然是很常见的，这一类蛋白还有一个专有名词：细胞因子cytokine。细胞因子从定义来说，就是一类能在细胞间传递信息的物质，主要包括具有免疫调节的功能性蛋白或小分子多肽。在细胞交互中，免疫相关的表型占了非常重要的位置，免疫细胞天生就具有跟其他组织细胞发生交互的使命。因此我们可以说循环RNA、外泌体之类的课题并不是什么全新的科研套路，这些模式在免疫学的研究中早就被淬炼了无数遍了，无非是套路的延伸而已。
- 对于Circulating蛋白，我们重点去理解细胞因子这类分子的作用模式，细胞因子最早 是从淋巴细胞和单核细胞里面发现的，所以之前是叫淋巴因子或单核因子，随后研究发现很多细胞都能分泌这一类蛋白。尤其当机体遭遇细菌、病毒等微生物的入侵，或者经过物理的、化学的因素诱发了损伤，都会刺激细胞因子的产生，而细胞因子可以杀灭细菌和抑制病毒，达到保护机体的目的。
- 细胞因子已发现的有上百种，根据功能大致可以分成：白细胞介素(Interleukin，IL)、干扰素(Interferon，IFN)、集落刺激因子(Colony-stimulating factor，CSF)、肿瘤坏死因子(Tμmor necrosis factor，TNF)、趋化因子(Chemokine)，生长因子(Growth factor，GF)一共六种。
- 细胞因子的功能研究一直是免疫学的一个热点方向，这些蛋白参与的生理过程包括调节T细胞、B细胞活化、生长和分化，介导细胞免疫和体液免疫，刺激造血生成、刺激骨髓祖细胞生长和分化为各种成熟血细胞。同时还可以调节细胞的病理过程，参与抗感染和抗肿瘤，参与组织修复、促进伤口愈合，在超敏反应和自身免疫性疾病中担当角色，人体的发热和炎症都跟它有关。
- 细胞因子是分泌蛋白，但并不是所有的分泌蛋白都是细胞因子，还有消化酶、抗体、多肽类的激素，像生长激素、胰高血糖素、肾上腺素也都是分泌蛋白。分泌蛋白在结构上的一个显著特点是：N-端会有一段特定的氨基酸序列肽段，又叫信号肽，在蛋白转运出细胞的时候，这段信号肽会被剪切掉，形成成熟的分泌蛋白。包含这种序列特征的蛋白就预示着他们是分泌蛋白，所以分泌蛋白是有特殊序列标签的，在基因注释网站检索分子背景信息的时候要对这一特征保持敏感度。
- 分泌蛋白需要结合受体细胞膜上的相应受体蛋白发挥生物学功能，这种配体和受体的结合就是机制研究的一种确定套路。膜上的蛋白也有特定的跨膜结构域，也可以被识别出来，因为蛋白研究相对比较成熟，所以对于一个蛋白在细胞内定位在哪里，是不是分泌以及是不是膜蛋白，全部都有根据序列分析过的结果，在Genecards数据库就有相关的内容。我们了解分子的特定类型，对于基础研究的设计走向尤其是机制的模式具有关键性的影响。
Circulating DNA
- DNA和RNA都是细胞里的，一般情况下他们不会直接分泌出来，如果需要参与细胞交互信号传递，正常采用经由囊泡运输的模式，也就是需要借助载体才能实现从一种细胞到另一种细胞的交互过程。
- 但是，如果细胞破了，也就是细胞自身裂解了，那么其中的DNA和RNA就有可能释放出来。这种DNA和RNA也是circulating的，它们有一个专门的名词，叫cell free DNA，或者cell free RNA，简称cfDNA和cfRNA。cell free的意思就是游离于细胞外，cfDNA和cfRNA是专属于循环分子中的一类，细胞内没有，它们构成了我们医学科研中变量的一种新分子类型。如果我们的研究对象是cfDNA、cfRNA，天生有一种诊断倾向的研究格式，形成了一种独特的研究套路，这部份内容我们在下一节课介绍。
- 人体细胞有自我的新陈代谢过程，每时每刻体内都有细胞会发生凋亡，凋亡是一种主动式的细胞降解，这个过程中会产生片段化的DNA，大小基本在一两百bp左右。除了主动的，还有细胞被动裂解，可以是来源于外界物理或者化学刺激引发的组织坏死，也可以是自身免疫系统对细胞杀伤作用，这个过程释放的DNA片段会比较大。
- 无论是主动还是被动产生的cfDNA，一般到了外周血中都会被快速清除，细胞又会释放新的cfDNA，形成动态平衡。在健康状态下，cfDNA一般是维持在一个较低的水平，人体内检测到的cfDNA含量实际上是DNA的释放和清除平衡后的结果。当严重的系统性组织损伤或者异常代谢打破这种平衡时，大量死亡的细胞释放cfDNA会使血液中的cfDNA含量大大增加，这就跟疾病的临床诊断挂上钩了，很有医学研究的价值。
- cfDNA的发现其实非常早，1948年就已经在人血液中发现了，但是当时对于DNA是遗传物质的认识还没建立，DNA双螺旋结构是1953年提出的，所以发现之后并没有引起很大的研究热情。在1977年的时候，第一次发现肿瘤病人血液中的cfDNA含量要比正常人高。到了1989年，证实了一部分cfDNA是来源于肿瘤细胞的，提出了liquid biopsy的概念，就是肿瘤精准医疗中的液体活检或者叫液态活检的起源。在2013年，在随后的研究中大量发现来自于肿瘤细胞的cfDNA可以检测出肿瘤特异的突变信息，才终于使这种体液活检技术成为能够大范围应用的现实。不难理解的是，传统的病理技术是需要从病灶获得组织，这种检查是侵入式的，没那么安全，有一定局限性。癌症有异质性，对于已经转移的肿瘤而言，仅取某个局部组织并不能反映患者整体情况。有些患者还不具备组织活检的条件，有些肿瘤在受到活检的操作后有加速转移的风险。那么液体活检的样本来自血液，是非侵入式的，就很有想象空间了。
- 当然，来自于肿瘤细胞的cfDNA量不是很大，尤其是早期的肿瘤病人，检测敏感度是个问题。能实现有效检测与最近十几年测序技术的快速发展也有巨大关联，测序技术的通量和精度现在已经很高了，这也是肿瘤的cfDNA被应用于个体化诊断，包括液态活检如今是转化医学热点的原因，这个方向是严重依赖于测序技术作为平台支撑的。
- cfDNA检测的转化应用最知名的案例就是新生儿无创唐筛，在孕妇血液中约有10%-15%的cfDNA来自于胎盘滋养层，这意味着可以通过母亲外周血测序分析了解其中的cfDNA序列，其中一部分信息来源于胎儿。而通过这一部分就可以判断胎儿是否存在整个染色体或者大片段DNA的变异，对于传统的羊水穿刺检测来说是一种颠覆，因为无创。
- 很多炎症性的疾病，因为同样会引发局部细胞的大量死亡，cfDNA水平也会发生显著变化。比如关节炎、肝炎、肾炎、胰腺炎、炎症性肠病、系统性红斑狼疮等疾病患者血液中，检测到cfDNA的量相比健康人大大增加，可以作为Biomarker。
- 在肿瘤中的cfDNA，还有一个专门的名词叫ctDNA，circulating tμmorDNA，循环肿瘤DNA，就是指来自肿瘤细胞的外周血cfDNA。ctDNA中能够检测到非常丰富的遗传变异信息，从位点突变，到基因组结构变异、拷贝数变异都能够检测到。可以想象ctDNA含量通常在晚期或转移性肿瘤中较高，而在早期或局限性肿瘤中含量较低。在不同类型肿瘤中，ctDNA水平也会存在差异，所以具体临床应用要探索，不能一概而论。ctDNA的转化应用潜力是可以作为肿瘤预后的标志物，而且也能够用来预测药物治疗的效果，实现个体化治疗。
- 说到ctDNA，还有一个概念也要了解一下，那就是CTC，循环肿瘤细胞(Circulating tμmor cell)。CTC是从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞，可以用来判断肿瘤的转移风险和病人的预后情况。早在1896年，研究人员就已经从一例转移性的肿瘤患者血液中，首次观察到从实体肿瘤中脱离并进入血液循环的肿瘤细胞，提出了CTC的概念，这种发现靠显微镜就可以了，所以历史很久远了。目前CTC计数可以用来预测一些肿瘤的治疗后无进展生存时间PFS和总生存时间OS，以此作为患者是否需要接受辅助化疗的参考，也可以动态监测CTC，观察接受化疗的肿瘤患者CTC的数量变化，作为肿瘤进展、转移复发风险评估的参考。另一方面可以实时反映肿瘤负荷，作为肿瘤药物耐药性的监测。
- CTC的临床价值还在于可以准确地提示肿瘤的发生，并且因为CTC在肿瘤早期就会产生，所以远远早于影像学证据。但是，从技术上来说，CTC在外周血中含量非常低，在癌前病变或肿瘤早期数目就更少了，检测的灵敏度很难保障。一般患者1ml血中大概平均只有1个CTC，而1ml血液里面有50亿个红细胞和上千万的白细胞，对检测技术是个考验。另外CTC检测还有特异性的问题，血液中一些细胞，比如巨核细胞、内皮细胞、未成熟的造血细胞、上皮细胞等，这些细胞在正常血液中比较少见到，比较容易被误认为CTC。因为我们判断CTC是不是肿瘤细胞是通过表面的Biomarker，理论上说这只能推断这种细胞可能是恶性肿瘤细胞，而不能进一步确诊到底为何种肿瘤细胞。还有没有影像学证据，也没法对症治疗，只能加强随访，这也是局限性。
- 总的来说，ctDNA的灵敏度高于CTC，因为ctDNA半衰期很短，只有几个小时，是实时更新代谢的，可以清晰反馈当前肿瘤信息，有治疗实时监控的潜力。但针对肿瘤早期筛查或诊断，CTC 的准确性优于ctDNA，毕竟早期的时候ctDNA含量太少了。
Circulating RNA/exRNA
- DNA比较稳定，所以cfDNA是比较可靠的循环Biomarker，但是RNA就没那么稳定了，非常容易被降解，因此cfRNA相对而言应用价值就没有那么突出。
- cfRNA的研究也是有的，它的来源跟cfDNA一样，主动或者被动的细胞降解就能释放出来，在血液中的cfRNA又叫循环RNA，circulating RNA，其他的体液也会有，尿液、唾液、乳汁、前列腺液、精液、经血等。这些游离RNA还有个名称是exRNA(extracellular RNA)，翻译过来是胞外的RNA，概念很多大家不要慌，有一些只是表述不同，意思其实差不多，我们应当掌握合并同类项的道理。cfDNA、cfRNA、ctDNA、CTC、exRNA都是cell free的，extracellular跟cell free是一个意思。cell free的分子除了近端的作用形式，要进入循环系统那就属于circulating的状态，所以一个分子前面有circulating的定语，你就知道它是cell free的，可以用于液态活检。
总结
- mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA都可能出现在exRNA中，通过某些病理过程的特殊机制，这一领域研究还比较前沿，很多问题尚无定论。但有一点是肯定的，就是exRNA更倾向于坐车，用囊泡的形式分泌出来。有了外层膜的保护，RNA的稳定性就有保证了。这一类在囊泡中的RNA分子，尤其是起调节作用的非编码RNA:miRNA、lncRNA、circRNA，加上囊泡中的大热门——外泌体，外泌体携带非编码RNA介导细胞交互作用，这大概是当前这个阶段最具有模式创新属性的课题了，从分子类型到交互模式到逻辑套路都是高配的，高端大气上档次。
细胞外囊泡与外泌体简介
- 细胞外囊泡，英文是extracellular vesicles，简称EVs。
- 大家一说胞外囊泡第一反应是外泌体，其实是有三类常见的EV
- 第一种是凋亡过程产生的凋亡小体(apoptotic body)，体积最大，500nm-2μm，它伴随凋亡表型产生，所以只跟凋亡挂钩。
- 第二种是微囊泡(microvesicle)体积在100nm或200nm以上。
- 第三种外泌体(exosome)，体积小一点，一般说30-100nm，也有说到150nm的。
- 以粒径大小来区分微泡和外泌体是不太严谨的，就像lncRNA的定义是200nt以上的非编码RNA，但180、190的非编码RNA也是lncRNA。微泡和外泌体的区别还在于它们形成的机制不太一样，凋亡小体和微泡都是由细胞直接出芽形成的囊泡，外泌体的形成却要经历更加复杂的途径，中间要产生一个多囊泡体，因为大家不会去研究外泌体生成机制，所以我也不详细讲，有兴趣自己查资料就好了，只需要知道形成机制上，微泡和外泌体不一样就行。
- 从技术上来说，抽提外泌体的试剂盒也不能保证100%就是外泌体，它只能是把100nm粒径左右的囊泡给富集下来，你一开始就用了外泌体的试剂盒，从起点来说有目的，所以微泡的问题就自动被过滤掉了。我要教大家的就是化繁为简的思路，凋亡小体、微泡、外泌体这三类常见的胞外囊泡的知识是要知道的，但具体做囊泡介导的细胞间通讯，你的选择很简单：做外泌体。因为它包含的内容物和信号分子最丰富，这是当前研究主流。
- 早在1986年，外泌体就被发现了，最初是在绵羊红细胞的培养上清中找到的有磷脂膜结构的小囊泡，后续20年里，其他类型的细胞，主要是免疫细胞都发现了有功能性的外泌体，但真正得到大家关注还是在2007年，发现在肿瘤细胞和正常细胞外泌体之间的差异，其中携带的RNA可实现跨细胞的调控性事件，这在肿瘤微环境研究中是个突破性的证据。2015年，利用转基因小鼠模型，研究人员证实外泌体作为细胞通讯的载体具有广泛性，能够在全身水平上被其他细胞摄取并发挥调控功能。广泛性的证明非常重要，非编码RNA里的miRNA、lncRNA、circRNA都是因为被发现广泛存在引起研究热潮。
- 当前还有把外泌体中特异性表达的分子当作液态活检Biomarker的研究，还有把外泌体当作载药系统和靶向递送系统的研究。凋亡小体包含的是大量降解的核酸碎片、肽段和脂类分子，基本没有用于调控的完整的核酸分子，研究角度有瓶颈。而微泡和外泌体都是可以携带蛋白、脂质和RNA。RNA包括mRNA和非编码RNA，既然所有分子类型里创新最显著的是lncRNA和circRNA，那么加上了外泌体的外衣，这些新颖的非编码RNA分子类型依然要重点关注。
- 追新是科研的一个特点，国内这种追新风气在基金申请的时候表现得尤其突出，但是追新又不能表现得吃相很难看，会显得肤浅。你说你做外泌体circRNA的理由是：“什么新你做什么”，大家心知肚明。但是不要说出来，很尴尬的！要假装是因为前期工作到了这份上，才顺理成章做了这个，用足够的前期工作支撑，这就完美了。
全文总结
- 今天我们重点讲解了在第四层逻辑结构中，担当分子变量的具体类型，主要是循环分子和囊泡+分子。循环分子有DNA，就是cfDNA。肿瘤中有特殊待遇，叫ctDNA。cfRNA也有，但稳定性不高，cf蛋白就是分泌蛋白，以细胞因子为典型，这是老套路。经典是经典，但吸引眼球的效果一般。
- RNA加上囊泡的壳，稳定性的问题就解决了，微泡和外泌体搞清楚外泌体就行了，套路差不多。调控性的RNA加上外泌体，这是囊泡介导的循环分子参与细胞间交互作用最新颖的模式，miRNA+外泌体、lncRNA+外泌体、circRNA+外泌体，值得再进一步的学习和探讨。