补充：关于通路的一些基本知识
筛选通路的策略
- 在研究方法上，不管是药物还是分子的机制，筛通路都有一致的策略
- 加药或者操作分子的上下调，然后看通路明星蛋白的变化，可以用抗体库、蛋白芯片等通量的方法，观察到有变化的明星蛋白，再用WB验证一遍，机制就做完了。
- 也可以用通路抑制剂/激活剂，阻断通路变化趋势，看表型回复，确定完通路再验证里面的明星分子。
- 这种做法的好处是，用Rescue策略筛出来的通路和分子不用慌，一个通路就那么些蛋白，补上WB的变化趋势就OK了，通路的变化趋势基本跑不了
- 而且，Rescue这一步的关键证据在前面筛选时已经拿到了，心里很踏实，相当于相对难搞的步骤被抢先搞定了
- 对于医生做科研来说，蛋白芯片可以找公司外包服务，是一种做机制的高效策略
- 找一家做蛋白芯片的公司咨询一下，或者直接去公司网站查查看，跟通路相关的蛋白芯片产品 、那是包罗万象。
- 除了前面课程里介绍的以明星分子命名的通路，还有很多其他 Pathway可以作为潜在的研究对象
- 蛋白芯片号称通路研究大杀器，把能想到的几十种通路，每个通 路几十个蛋白，包括蛋白磷酸化形式的检测，一共几百上千位点放在了一张芯片里面，可以一次性高通量的读出所有这些通路分子的变化情况。
- 加了个药，或者过表达/敲掉了一个分子，这一千多个通路蛋白肯定是有变化的。做完芯片， 有差异的点再去订抗体Western验证一下，你的通路机制基本就做完了（当然还可以rescue）。
- 以通量解决概率问题，通路芯片+Western 是基本上百分百能做出机制的万全策略。
- 除了大杂烩的，还有几百几十个点位的小芯片，聚焦于某一个通路的。可以大芯片做完再来个小芯片验证一下， 然后western挑几个关键的变化一做，步步为营。
要论最简单高效适合医生的通路机制做法， Pathway Array蛋白芯片便是。
KEGG pathway对信号通路的分类
代谢
遗传信息的传递
- 基因转录、翻译
- 蛋白的转运、降解等
环境信息代谢
- 膜转运
- 信号转导
- 这是疾病中最活跃的一类，和医学研究息息相关
细胞生物学过程
- 细胞周期
- 细胞凋亡
- 细胞自噬
- 细胞黏附等
- 一个表型就是一个通路（后面会细说）
按照器官和系统分类
- 神经系统
- 循环系统
- 免疫系统
疾病
药物
信号通路的命名与分类
以通路里起到关键作用或是最初发现的分子名称命名
- 举例：AKT， JAK-STAT，WNT，TGF-β
- 这么取名字的通路的大部分都比较”博爱”，什么疾病和表型都能搭上，只有用分子命名，性质上才比较中立
- 想拿下通路的常识，重点把这类百搭通路里面选几个精细地学习，剩下的用到的时候再去研究。作为一个动态的知识体系，即使今天全部记 下来了，隔些天新的文章一出来认识又要刷新知识，所以抓大放小就好。
直接以表型来命名
- 举例：Cell cycle细胞周期，Apoptosis凋亡，Autophagy自噬，Angiogenesis血管生成，Endocytosis细胞内吞等等
- 在文章里，表型命名的通路很少以Pathway的概念出现，一般就是 Biomarker的用法
- 这种命名法的通路，提示的是跟表型相关的一堆明星分子组成的分子集。某个表型研究的机制越深入，相关分子报道就越多，积累到一定程度就可以被人总结成为一个独立的 pathway。
- 迅速学习某个明星表型背后的biomarker的方法：去KEGG pathway找这个表型命名的通路，找到这个条目后常识信息就尽在其中了，可以省去很多查文献的时间
以分子家族命名
- 举例：整合素integrin，白介素interleukin，趋化因子chemokine，T细胞受体T cell receptor
- 这种家族在结构、功能和作用机制上都有相似之处，理解了其中一个成员，其他的可类推。
- 以表型和分子家族来命名的通路， 对我们学习基础科研构不成大的障碍，反而是有利于理清思路的
补充：解螺旋体系下的医生科研成长体系
- 学基础科研，会找分子做表型，完成单变量论证，这是第一步。
- 很多同学做完第一步已经是强弩之末，面临毕业机制就不想做了。其实从第一步到第二步，跨越会相对容易，就是掌握筛通路和验证明星分子的一套做法。通路机制是间接机制的主流，大家重点领悟，会玩通路，三五分已经是驾轻就熟了。
- 真正的难度在于分子和分子间直接作用的机制，这是拉分项目， 会不会做是能用来区分开业余选手和职业选手的标准。
- 对职业科研人员而言，会研究直接作用机制是吃这碗饭的基本要求。
- 对医生而言，直接作用机制的研究一不小心就是进退两难，欲仙欲死。做的过程中主要是想死，做出来之后能发5分往上，感觉自己又成仙了
三元变量组合简介
- 二元变量的4种模式是多元变量关系的基本构成单元，三元变量对于一个研究对象，往上找驱动因素， 往下找效应环节，可以形成逻辑闭环，给出一个完整的科学故事，也就是目标分子“调控了谁，又被谁调控”的故事。
- 三元变量是最完美的基础科研课题设计，如果在一个研究对象上既回答了下游通过什么机制来发挥作用，又回答了上游是由什么机制，导致表达增高/降低/受到特殊调控修饰的，这无疑是一个逻辑清晰引人入胜的story
- 基础研究中的三元变量就是解答了一个科学现象，也就是表型背后的三个关键科学问题: 主变量是谁?被上游哪个因变量调节?下游调节哪个因变量?这三个问题在三元结构里得到圆满解决，就像在西游记里，唐僧一碰到人就念叨“贫僧法号三藏，自东土大唐而来，要往西天取经而去”。
- 三元变量是套路化的研究结构能达到的文章水平的极致，差不多10分。一共一万多本SCI期刊里面，IF在10分以上的只有两百多一点，做科研发10分那已经是飞翔在云端的感觉了。10分往上，原创性的idea特别重要，你所解决的问题是不是有实际的意义也很关键，数据结构只是为了论证问题而存在，根据论证的需要灵活配置
三元变量的设计结构
三元变量要首先拆分成二元结构来处理，也就是先两两配对，把调控关系证明完，接着通过Rescue验证证明必要性
做三元变量的时候，依然要用到二元论证的策略，不可跨越。
- 先两两配对把调控关系证明完，然后用Rescue把变量串起来。
- 举例：上一策讲了二元组合里面的药物+分子、药物+通路、分子+通路，我们合并一下就变成了药物+分子+通路。假设我的课题创新性在分子上，药物+分子+通路中，把分子作为主变量，药物就是分子上游的驱动因素，对药物来说分子是新发现的作用靶点，而通路是分子下游的效应环节
- 分子要创新，也就是要找药物作用的新靶点，需要筛，筛加药之后发生变化的新分子，通过药物对分子的调控关系来找Candidate。如果运气不错，筛选加上验证，找到了一个药物调节的新靶点，把调控关系坐实了，那么接下来要获得关键性的证据，也就是Rescue实验阻断了这个分子后，药物的药效是否受到显著影响。通过这些研究证据，就把药物和分子二元关系联系起来了，有调控有Rescue。
- 下面，再做分子与通路的关系。用药物、分子、通路三元组合的时候，分子跟通路有没有文献已知报道，就关系到需不需要提供实验证据解释和证明。在论证逻辑上，既要证明分子是药物的靶点，又要证明分子是调控通路的开关，两部分实验的工作量加起来几乎是翻番上去的。
- 在药物+分子+通路这个三元组合里，如果分子和通路的关系已经有报道，那么它的档次跟二元变量基本一样，只是一个延伸性补充验证，没有提出什么原创的调控机制。要把这个分子真的当作一个三元变量的课题，药物调节分子以及分子调节通路都应该是首次发现，相当于把2篇二元变量的”小”文章的科学假设合并成一篇大的。
- 这不是简单的加法，因为 2 篇 3 分的加起来也比不上一篇 5 分有水平。能做 5 分的 课题不要做一半就发掉，覆水难收，前半段二元关系发掉后，后半段故事就始终是残缺的， 提不上那一口气。
三元变量的逻辑拆解
变量间调控关系证明
- 药物调节分子的表达
- 分子影响通路的表达
- 药物对通路的表达有影响
- 第一个Rescue：药物调节通路依赖分子，把分子表达RNAi掉，看药物对通路的影响还在不在
围绕表型的Rescue
- 药物调节表型依赖于分子
- 分子调节表型依赖于通路
- 药物调节表型依赖于通路
两个二元关系的直接作用细节
- 药怎么调节分子
- 分子怎么作用于通路的具体机制
省略的三元变量论证逻辑
在三元以及更多元的文章论证中，几乎没有完美论证的实例。
全部逻辑证据都做到实在太麻烦了，在一定程度上进行合理的省略是套路的精髓
- 主变量调节下游因变量，下游选一个已知跟表型相关的，这样因变量对表型的单变量论证就会省略。
- 主变量会采取一正一反的论证手段，但是rescue验证往往只会做一边，另一半工作会省略
- 在三元论证里，如果药物与表型已知，那就不用论证了，单变量减去一条
- 二元论证里，药物调节分子以及药物调节通路其实是一个实验里做的，加药，并且同时观察分子和通路marker的变化，所以3条可以合并为2条
- Rescue论证里， 把变量间的Rescue先省掉
- 跟表型有关的3条里，对于药物介导表型依赖于通路，里面没有主变量分子，这个戏份不是最重要，想省也可以省掉
总结
- 在以分子为主变量，而且药物和通路调节表型已知的情况下，下面的这几条是一定不能省掉的
- 分子调节表型
- 分子调节通路
- 分子调节表型依赖于通路
- 药物调节分子和通路
- 药物调节表型依赖于分子
以分子为主变量的三元变量课题选择
- 有了分子的新，药物就不需要很新，特别新反而把问题搞复杂了
- 一个不知道什么作用的药，再加上功能表型还不是那么清楚的分子，这个课题的论证负担就会非常大
如果是做新药机制的课题
- 建议选择药物+通路，或者药物+分子的二元变量结构来研究，逻辑清晰，发文章速度也快
- 如果一定要做三元结构，主变量设定为药物的，分子稍微明星一点反而可以给人安全感。这时候， 延伸性的再加一个通路机制依然有锦上添花的效果，但从头建立分子和通路的调控关系，甚至通路和表型之间的关系也依靠原创，那么论证过程中还会有乱中出错的负担。
- 总而言之，我们需要注意区分，主变量放在不同的位置对套路的设计会产生差异
- 新药做药效，找到分子靶点再傍上一条明星通路可以算是二元plus，确实比二元厉害，因为多了通路这个变量，但真正的三元是围绕主变量的上下游三元，主变量应该是分子而不是放在头上的药
- 一旦以药物为主变量， 从哪来的问题没有了，说的都是到哪去，哪怕后面再串更多的变量也还是虚有其表，名不副实。就像没有Rescue的机制都是水货，没有上下游的三元也是冒牌的
现实中一个可能的科研实操方案
- 先找一个稳定的药学合作伙伴，解决上游新药组分源源不断供应的问题
- 然后在细胞模型上筛一下药效，有效的单体或者有效部位把表型的数据补充完整，细胞模型+动物模型功能做完
- 接下来，机制上做一个广谱的通路芯片筛一遍，有变化的通路用特异性的抑制剂做个 Rescue验证，验证通过则继续找能够调控这条通路的分子靶点，Rescue验证通不过就转而把药效+通路明星分子变化组成一篇灌水的文章发掉
- 在已经知道某个通路是药物发挥作用的必要途径后，找一个能够Rescue的关键的分子靶点，在基础科研里面属于比较简单的问题，无非就是工作量，走筛选+验证的路子。
- 表面上看是药物→分子→通路的顺序，然而以药物为主变量的时候，往往是先定通路再找分子靶点。做得成，看起来是三元可以冲5分，做不成，药物+通路，有Rescue，三分也是妥妥的。
- 总而言之，在工作量和工作顺序的安排上，有药物，先筛分子再验证通路，其实并非上上之选。
补充：表型相关性与学术品味
- 利用表型之间的内在联系，可以提升猜分子的命中率。
- 表型相关性也可以叫表型交互(cross-talk)，其本质是同一个分子可以参与介导不同的表型
- 除了表型cross-talk， 通路也有cross-talk，一个分子既可能调节通路A，也可以调节通路B，甚至更多，但是一个分子变量，完全没有必要在一篇文章中又做A通路，又做B通路
- 只有在低水平的文章里，才会看到作者把几个通路的蛋白Western结果放在一起，却没有一条通路做得很深入的，全是蜻蜓点水，点到为止，这种数据呈现形式远没有一条通路上下游蛋白放在一 起检测有说服力。
一篇文章多做几个表型，或者多做几个通路显得内容更丰富，是初学者容易产生的误区，好的故事永远是聚焦的。
补充：三元变量的排列组合
- 就像二元变量里没有药物+药物，以及通路+通路的组合
- 三元变量组合的时候，药物+通路+通路，药物+药物+通路，或者分子+通路+通路都是没有意义的
三元变量的经典组合就两种
药物+分子+通路
分子+分子+（）
- （）内是分子还是通路的区别：下游找效应环节的时候，是傍上了一个通路，做了间接作用机制，还是从分子相互作用入手，阐释直接作用机制；从本质上说，两者在逻辑上差别不大