- 已知分子介导某种表型，想要解释背后的作用机制是什么，也就是研究分子机制，有一个最最基本的核心问题：主要研究对象调控了谁，又被谁调控?我们的主要对象可以是编码基因，也可以是非编码 RNA。不论如何，一篇文章有且只能有一个主要研究对象
- 确定了主要研究对象，再问一句它调控了谁以及它被谁调控，就形成了分子机制研究的中心思想。
- 它调控了谁是指下游的效应环节，一般是明星分子或通路。
- 它被谁调控是指上游的驱动因素，可以是分子、药物，但不会是通路。
- 通路是一组分子，相当于标Biomarker，常用来解释表型发生的终端效应，是表示一种结果而不是原因。
- 主变量往下游找效应环节，往上游找驱动因素，文章的构成要素就从单变量转化成了变量间的组合，单变量讲究的是统一，二元变量的特征就在于变化
- 基础科研的变量有药物、分子和通路，药物只做主要变量，通路只做次要变量，分子主次皆可，所以二元变量组合理论上有 4 种：药物+分子，药物+通路，分子+通路以及分子+分子
包含药物的二元变量文章结构
药物+通路
- 这一类组合常见于中药或者天然产物的课题中，在国自然十处：中医、 中药、中西医结合里面，这种套路的项目不少
- 中药和天然产物的药效成分本身比较复杂， 即使对单味药分到了多糖类、黄酮类、多酚类、苷类、萜类这样化学性质相似的分子群，还是一堆化合物而不是单体。这种机制本来就很难说清楚，所以很多时候就往通路上靠，具体来说就是在加药之后检测一下明星通路分子表达的变化，通过一组具有代表性的通路关键蛋白的表达变化来提示药物对通路的调节作用
- 药物作为主变量本身没有过表达和RNAi沉默一正一反的操作，只有加药和不加药进行比较，最多增加一个药物剂量梯度，之后就是加药观察细胞、动物模型上表型的改变，确定有无效果
- 创新的药效物质保障了课题的学术价值，接下来回答一个Why的问题，把通路作为下游机制检测一堆通路蛋白Western， 这就是有分子机制的 SCI了，数据扎实一点过三分没问题，有细胞，有动物，有通路变化，有Rescue就算是合格
- 药物+通路属于典型的间接作用机制，知道通路里面关键的marker表达被调节了，但到底是药物作用在哪个分子上调节是不确定的。这种论证结构的瓶颈大概在四五分，无论怎么增加平行的工作量，逻辑上就这么浅，过5分很难
药物+分子
- 为了有力度地说明一个药物发挥作用的过程中，某一个已知功能的分子是其效应靶点，Rescue实验是不可或缺的环节。
- 举例：有个药物是促进细胞凋亡的，加了药，发现有个已知跟凋亡表型相关的分子上调了，那么Rescue实验的设计就是在加药的同时，转一个靶分子的siRNA进去，把药物对这个分子上调的作用阻断掉，然后看药物介导的表型有无。如果表型没有了，那就说明药物发挥作用确实需要依赖于这个靶点
药物+分子式课题的证据链
- 药物介导表型
- 药物调控分子
- 分子与表型相关（这一条一般是选已知明星分子，所以不必论证）
- 阻断了药物对分子的调节，则药物对表型的作用会无效化，也就是被回复
- 经过这四条证据的推演，我们就可以得出科学假设：药物经由分子介导了表型
- 这里还需要注意一点，即使有Rescue，也还不能证明药物对分子是直接作用。Rescue 只是验证了分子是必要的环节，至于是间接还是直接，还需要提供更多的研究证据，比如后续研究证实药物能够影响蛋白的泛素化修饰，或者影响mRNA的稳定性，或者调控转录的过程
- 同样是解释机制，直接作用和间接作用的证据强弱程度是完全不同的，造成最终文章的档次也大不一样，一般SCI有机制就可以过三分，但要上五分往往需要直接作用机制
- 把一个分子作为机制来套的时候，不会选跟表型关系不明确的分子，主变量承担文章创新任务，但因变量必找明星，屏蔽创新。这样新老搭配，把主变量和因变量的调控关系证明清楚，才能对一个科学问题产生完整解释
- 如果扯上一个跟表型的关联还没有建立的分子作为因变量，增加了额外的论证工作量不说，一篇文章到底谁是主角你自己都分不清楚，条理逻辑就全毁了
其他讨论
- 比较创新的药物做机制可以省点力，靠一个明星通路就能交差了
- 如果药物本身没有什么创新性，或者研究常见药物的耐药问题，那么选通路凑机制就太没亮点了，这时候就要找个稍微新一点的分子靶点组合起来，甚至是考虑lncRNA、circRNA这种创新比较强的分子类型。
- 这种情况下主变量就转移成了分子，药物变成了上游的因变量，但还是药物+分子的二元组合
分子+通路的常见二元变量
- 分子+通路是最普遍的二元变量套路，低分SCI里大概有一多半都是这种组合
- 单变量的5步法：表达差异，正反回复，细胞动物。这套规定动作打完，发个2-3分的文章实在有点可惜，接下来要用比较少的预算来提高文章档次，最好用的策略是靠通路，找几个通路明星蛋白Western检测一下，再Rescue验证一遍，虽然是间接作用机制，但加分效果明显
- 一个分子即使在同一个表型下也有可能有不同的机制，在不同表型里介导不同机制就更正常了。
- 基因的功能可以被代偿，因为一条路走不通，它可以换一条路走，只能走一条路是高风险的，意味着一旦这条路出了什么问题后果很严重，可能致病，更严重致死。这种包含高风险的线性调控模式在进化过程中被淘汰掉是大概率事件，现有的高等生命形式倾向于网状的调控模式。
- 在网状结构里一条路是不是足够重要，重要到能够被称为关键信号转导途径，金标准是通过Rescue实验来检验，在功能基因组学研究中，Gain of function，Loss of Function以及Rescue并称为三大策略支柱。配上了Rescue的分子机制才是行货，没有Rescue的标签，机制研究只能算水货。这种逻辑上的瑕疵很容易成为审稿人的攻击对象，所以能不能蒙混过关要看投稿时的运气了。
分子+通路环节的筛和猜
- 当采用分子+通路的策略做研究的时候，表型做完，通路应该怎么结合上去呢?这是机制研究阶段的筛、猜智慧。
- 跟选主变量分子不同的是：主变量筛、猜的时候，第一条标准就是新，别人已经报道过的忽略掉，只找那些能全世界领先的分子来做。而下游机制筛、猜策略恰恰相反，凡是跟表型关系不确定的，通通不管，只找那些一旦联系上就回答圆满的通路和分子来解释，用最简约的二元结构解释清楚一个完整的故事。
- 接下来介绍常见通路机制筛和猜的3种做法
方法1:抗体库
- 本质是找调控关系
- 也就是大量地做western，检测明星通路蛋白的表达变化
- 明星通路的抗体因为做的太普遍了，不一定需要买进口的，国产的也一样好用。经常玩这种机制套路的实验室应该备一套常见通路抗体，建一个抗体库，学生们一级一级都可以传下去用
- 还有一个办法， 现在很多做Western技术服务的公司，他们本身有抗体库。直接说做什么通路蛋白，抗体不需要研究者来提供，用公司库里的抗体就好了
- 抗体问题搞定的情况下，我们要有策略地做分批验证，具体来说，就是每个通路选1-2个关键分子
- WNT通路的β-catenin
- PI3K/AKT通路的p-AKT
- JAK-STAT通路的p-STAT3
- 如果发现了某一个通路活性的明显改变。再去做那个通路的上下游几个明星蛋白的检测，这里即使发现了好几个通路都没关系，一篇文章里只做1个通路
方法2:通路芯片，尤其是蛋白芯片
- 和方法1一样，本质也是找调控关系
- 这种商业化的蛋白芯片预包埋了几百个甚至上千个位点的抗体，检测方便通量高。市场的芯片产品可以说应有尽有，既有那些百搭通路的，也有根据某一种疾病或者表型的marker设计的，比如转录调节蛋白家族、核受体、DNA 损伤修复、免疫、炎症等等，可以一次性读出一大堆明星分子变化
- 除了蛋白芯片，还有检测mRNA表达的芯片和PCR通路芯片产品
- 在没有抗体库的情况下，自己又没有很具体的研究方向，那么用这些高通量工具筛一筛性价比较高。这样的筛选不需要用到大量样品，相当于预实验，最简化的一组对照组一组实验组就够了，文章里要用数据了不起做三个重复
- 考虑到无论是蛋白芯片，还是mRNA芯片的结果，最终还是要Western 来验证才算合格，可能还是直接做蛋白芯片比较好，都是蛋白水平，更容易验证出来。
- 注意：要留同一批的样品来做芯片和后续的Western验证，不要用不同批次的样品，可能造成研究偏差
方法3:通路的激活剂和抑制剂
- 逻辑思路类似于rescue思路，操作上有，阻断下游，然后看表型有没有被改变
- 主要是抑制剂，因为一般做功能都是激活了某个通路导致表型，加了通路抑制剂阻断发现表型变化了，就能建立逻辑关联，9条常见的通路，备个十几种抑制剂就差不多了
- 无论研究什么分子上去这么一筛，后面机制往哪走的方向就锁定了。接下来还是做Western验证，跟第一种方法的后半段一样
注意：上述环节研究的还是间接机制，直接机制要看分子-分子这种二元变量设计
